家蠶圍食膜的蛋白質(zhì)組及幾丁質(zhì)去乙?；傅墓δ苎芯?pdf

1、幾丁質(zhì)(Chitin)是由N-乙酰葡萄糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNAc)經(jīng)β-1,4糖苷鍵連接而成的寡聚物，是自然界中廣泛存在的天然有機(jī)化合物之一，其數(shù)量僅次于纖維素。幾丁質(zhì)廣泛存在于真菌及藻類的細(xì)胞壁、無脊椎動物的外骨骼及表皮。前人的研究證明，幾丁質(zhì)是昆蟲表皮和圍食膜(Peritrophic membrane,PM)的重要組成成分之一，昆蟲生長、發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都需要一定量的幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)代謝隨著昆蟲不同生長

2、發(fā)育階段而變化，因此，幾丁質(zhì)在昆蟲的正常生長發(fā)育過程中有著至關(guān)重要的。家蠶(Bombyx mori)既是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，也是鱗翅目昆蟲的典型代表。家蠶圍食膜已知的主要組分有幾丁質(zhì)、蛋白質(zhì)，圍食膜蛋白質(zhì)對維持著圍食膜的結(jié)構(gòu)的完整性，蛋白質(zhì)多糖的疏水性則有助于圍食膜幾丁質(zhì)微纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，并維持其強(qiáng)度。圍食膜作為家蠶體內(nèi)防御病原微生物入侵的第一道防線，通過降解合成的幾丁質(zhì)或破壞蛋白與幾丁質(zhì)的結(jié)合，即可以抑制圍食膜的形成以及昆蟲的生長發(fā)育

3、等，達(dá)到防治害蟲的目的，具有極大的發(fā)展?jié)摿Γ瑫r(shí)也是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。
　　 在昆蟲中，幾丁質(zhì)去乙?；?Chitin Deacetylase，CDA)不僅是圍食膜重要結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)之一，也可以對幾丁質(zhì)進(jìn)行修飾，因此，可作為破壞圍食膜結(jié)構(gòu)的新靶標(biāo)。本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對家蠶圍食膜進(jìn)行全蛋白質(zhì)組分析，篩選家蠶BmCDA7蛋白質(zhì)，對家蠶CDAs家族成員進(jìn)行系統(tǒng)分析。利用原核表達(dá)的重組蛋白質(zhì)制備多克隆抗體，分析其在組織和時(shí)期中的表達(dá)方式

4、。通過真核表達(dá)得到具有活性的家蠶BmCDA7蛋白，首次比較準(zhǔn)確的測定昆蟲CDAs的活性，然后對家蠶中腸特異BmCDA7基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)和干涉，檢測中腸圍食膜的變化，研究家蠶CDA基因與幾丁質(zhì)的關(guān)系，進(jìn)一步闡述家蠶BmCDA7基因的功能。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.家蠶圍食膜的結(jié)構(gòu)及其蛋白質(zhì)組成家蠶圍食膜包裹著食物，為無色、透明的管狀結(jié)構(gòu)，類似于Ⅰ型圍食膜。解剖過程中發(fā)現(xiàn)圍食膜幾乎布滿整個(gè)中腸，并且富有彈性。從家蠶橫切面可

5、以清楚的看到有圍食膜位于食物和中腸之間。通過幾丁質(zhì)染色，證明家蠶圍食膜和其他昆蟲的結(jié)構(gòu)也是一樣，都是由幾丁質(zhì)絲組成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，圍食膜的這種結(jié)構(gòu)保證了其對中腸的防護(hù)功能。
　　 對家蠶圍食膜進(jìn)行掃描電鏡觀察，從家蠶圍食膜的外表面可以發(fā)現(xiàn)家蠶圍食膜至少有兩層，內(nèi)表面絕大部分是光滑致密，具有明顯的褶皺，該結(jié)構(gòu)不僅有利于食物的吸收，而且對中腸的保護(hù)作用。
　　 我們對家蠶五齡第3天圍食膜的總蛋白質(zhì)進(jìn)行shotgun分析，最后成功

6、鑒定305個(gè)可信度較高的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)的分子量大部分分布在8.02 kDa和788.52 kDa之間，除了兩個(gè)蛋白質(zhì)例外:BGIBMGA010471-PA的分子量大小為1538.87 kDa，BGIBMGA006856-PA的分子量甚至達(dá)到2002.29 kDa;但是小于100 kDa的蛋白質(zhì)還是占大多數(shù)的，占79.34％。家蠶圍食膜蛋白質(zhì)極酸蛋白質(zhì)和極堿蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)分別為3.39和12.91。
　　 我們同時(shí)構(gòu)建了圍食膜

7、的雙向電泳圖譜，檢測到較為明顯的蛋白點(diǎn)在60多個(gè)，這些蛋白質(zhì)點(diǎn)主要分布在分子量10～60kDa，等電點(diǎn)pI4～9的范圍內(nèi)。通過MALDI-TOF MS鑒定，有12個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到了鑒定（均包含于shotgun數(shù)據(jù)中）。通過信息分析和功能注釋，我們找到了兩個(gè)較為重要的圍食膜結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì):Chitindeacetylase（幾丁質(zhì)去乙?；福?、Peritrophic membrane chitin binding protein2（圍食膜幾丁質(zhì)

8、結(jié)合蛋白質(zhì)2）。
　　 利用GO分類對鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能分析:305個(gè)蛋白質(zhì)中有216個(gè)蛋白質(zhì)獲得至少一個(gè)GO號，這些蛋白質(zhì)被分為三大類，主要參與細(xì)胞成分、分子功能和生物過程。對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行KEGG pathway分析，他們主要分為代謝(metabolism)，遺傳信息處理(genetic information processing)，環(huán)境信息處理(environmental information processing

9、)，細(xì)胞過程(cellular processes)，有機(jī)體系統(tǒng)(organismal systems)和人類疾病(humandiseases)五大類。它們具體主要參與蛋白吸收和消化、碳水化合物代謝、解毒代謝及免疫反應(yīng)過程等。其中消化系統(tǒng)(digestive system)在有機(jī)體系統(tǒng)中占有比例最高，而參與免疫系統(tǒng)(immune system)的有5個(gè)pathway。這正好解釋圍食膜不僅幫助中腸進(jìn)行酶解食物等消化吸收作用，還可以參與了家

10、蠶的免疫防御過程，對中腸起保護(hù)作用。我們比較感興趣的正是這些與免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)，比如，Cadherin membrane protein、AminopeptidaseN、Alkaline phosphatase、Serine protease、Lipase等。通過芯片數(shù)據(jù)分析，這些蛋白質(zhì)都是在中腸高量特異性的表達(dá)。通過RT-PCR對具有幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)和絲氨酸蛋白酶抑制劑對應(yīng)的基因進(jìn)行表達(dá)檢測，進(jìn)一步確認(rèn)它們都是中腸特異的基因，由此，我

11、們推測這些蛋白質(zhì)應(yīng)該都是圍食膜的蛋白質(zhì)。
　　 2.家蠶BmCDA7基因的全長克隆及序列分析結(jié)合家蠶基因9×數(shù)據(jù)，利用Race技術(shù)我們獲得了BmCDA7基因全長cDNA序列1357bp（含ployA）大小，該序列具有一個(gè)1140bp大小的編碼區(qū)，27bp大小的5'UTR和190bp大小的3'UTR。該基因定位于28號染色體，編碼379個(gè)氨基酸，前面16個(gè)氨基酸為信號肽，分子量為41.26 kDa，等電點(diǎn)為5.12，富含15個(gè)半胱

12、氨酸，具有一個(gè)幾丁質(zhì)去乙?；附Y(jié)構(gòu)域。在第168個(gè)氨基酸可能發(fā)生N連接-糖基化，在第209，215個(gè)氨基酸可能發(fā)生O連接-糖基化。
　　 從家蠶基因組中鑒別出了8個(gè)家蠶CDAs基因，并把它們命名為BmCDA1～BmCDA8，它們都具有一個(gè)幾丁質(zhì)去乙?；腹δ苡蚣拔鍌€(gè)典型的motif所有CDAs成員都具有信號肽和糖基化位點(diǎn)，其中BmCDA2和BmCDA5都具有兩種拼接形式，其中只有BmCDA3和BmCDA4沒有EST證據(jù)。系統(tǒng)發(fā)生

13、分析結(jié)果表明，昆蟲CDAs分為5類群，BmCDA7屬于V群，僅僅只含有幾丁質(zhì)去乙?；附Y(jié)構(gòu)域。
　　 結(jié)合家蠶全基因組的表達(dá)譜芯片和RT-PCR的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)BmCDA7基因在胚胎第9天后開始表達(dá)，一直持續(xù)到五齡第7天，以后基本不表達(dá)。這個(gè)時(shí)期正好是家蠶中腸從形成到凋亡的過程。另外BmCDA7基因在每齡起蠶都比眠蠶表達(dá)量有所提高，這個(gè)正是家蠶圍食膜更替的時(shí)間點(diǎn)，暗示著該基因可能跟圍食膜的更新有關(guān)。
　　 3.家蠶BmCDA

14、7基因的原核表達(dá)及組織定位將BmCDA7基因的編碼區(qū)亞克隆到p28表達(dá)載體，構(gòu)建成p28-BmCDA7原核表達(dá)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株，以加入終濃度為0.2 mM的IPTG，37℃培養(yǎng)4h為誘導(dǎo)條件，與對照相比，在35～45 kDa之間位置處有特異條帶，與目的蛋白預(yù)測分子質(zhì)量大小相符合，說明均BmCDA7重組蛋白獲得了表達(dá)。經(jīng)蛋白組分鑒定發(fā)現(xiàn)，BmCDA7重組蛋白以包涵體的形式在大腸桿菌表達(dá)菌株表達(dá)。
　　

15、 利用Ni柱結(jié)合切膠的方法純化原核表達(dá)的BmCDA7重組蛋白，并成功制備BmCDA7重組蛋白的多克隆抗體。Western blotting檢測家蠶組織中BmCDA7蛋白質(zhì)的分布情況，結(jié)果表明BmCDA7蛋白質(zhì)在家蠶5齡3天的中腸和圍食膜中都能夠檢測到，在前腸、后腸和除去消化道的整蠶都未檢測到，表明BmCDA7蛋白質(zhì)在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平上都有表達(dá)，并且在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)情況相一致。證實(shí)BmCDA7蛋白質(zhì)在中腸和圍食膜是

16、特異的蛋白質(zhì)。
　　 4.家蠶BmCDA7基因的真核表達(dá)及其蛋白酶活測定將BmCDA7基因亞克隆到pPIC9K真核表達(dá)載體，線性化質(zhì)粒DNA后電轉(zhuǎn)化GS115菌株上，通過轉(zhuǎn)化子篩選獲得整合入酵母染色體上的重組酵母重組質(zhì)粒，在畢赤酵母中進(jìn)行真核表達(dá)。Western blotting的結(jié)果進(jìn)一步確實(shí)目的蛋白質(zhì)得到了表達(dá)。誘導(dǎo)96h的上清液經(jīng)過硫酸銨粗純化后，再用PEG20，000進(jìn)行濃縮。參考前人對CDA酶活的測定方法對粗純化BmC

17、DA7重組蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行酶活測定。我們測得粗純化BmCDA7重組蛋白質(zhì)樣品的酶活力為1.85U/mL。
　　 5.家蠶BmCDA7基因的功能研究為了獲得可遺傳的轉(zhuǎn)錄后基因增量表達(dá)或基因沉默，我們構(gòu)建了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因載體:轉(zhuǎn)基因增量表達(dá)載體pBac[P2-BmCDA7-SV40，3×P3-EGFP-SV40]，轉(zhuǎn)基因干涉表達(dá)載體pBac[P2-BmCDA7S-I-BmCDA7A-SV40，3×P3-EGFP]。顯微注射非制育蠶卵，并在

18、G1代進(jìn)行熒光檢測，均獲得了轉(zhuǎn)基因陽性個(gè)體。利用反向PCR技術(shù)，對轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)的插入位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)基因增量和干涉表達(dá)系統(tǒng)的插入位點(diǎn)分別位于第10號染色體的nscaf2859上以及第15號染色體的nscaf2888上。
　　 分析兩個(gè)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中的圍食膜通透性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的圍食膜內(nèi)腔中藍(lán)色葡聚糖的含量都要比對照多，說明了這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的圍食膜通透性都比對照有所提高。通過圍食膜超微結(jié)構(gòu)的觀察，我們發(fā)現(xiàn)這兩

19、個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中的圍食膜上的幾丁質(zhì)都發(fā)生了明顯的變化，都有所減少或變小，其排列也不同于對照?？赡苁怯捎谠谠隽勘磉_(dá)轉(zhuǎn)基因系中BmCDA7蛋白提高了，幾丁質(zhì)被過度修飾了，從而影響了通透性;而干涉了該基因后可能是由幾丁質(zhì)合成后沒有該酶的修飾，發(fā)生了幾丁質(zhì)畸形。進(jìn)一步對圍食膜的幾丁質(zhì)含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的圍食膜幾丁質(zhì)的含量都比降低。這些變化可能就是引起這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的圍食膜通透性提高的原因。綜上，我們推測BmCDA7對幾丁質(zhì)的修