大豆C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與鑒定.pdf

1、鋅指蛋白是一類廣泛存在于原核和真核生物體中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中均起著重要作用.C2H2(cys2/His2)型鋅指蛋白又稱為TFⅢA類鋅指或經(jīng)典鋅指,是鋅指蛋白家族中最大的一個(gè)亞族,也是真核生物轉(zhuǎn)錄因子中研究最多的一種與DNA或蛋白質(zhì)結(jié)合的模式結(jié)構(gòu).目前報(bào)道的植物C2H2型鋅指蛋白主要參與植物各個(gè)時(shí)期的生長(zhǎng)發(fā)育,以及脅迫應(yīng)答的調(diào)控過程. 本研究通過分析GenBank大豆EST數(shù)據(jù)庫中已知的兩段保守序列,發(fā)

2、現(xiàn)它們的3'和5'端拼接后其重疊部分具有100﹪同源性,表明它們是同一個(gè)基因序列的兩個(gè)片段,該序列與已發(fā)現(xiàn)的大量的植物中的C2H2型鋅指蛋白保守基序具有很高的同源性.根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異性引物,進(jìn)行RT-PCR,獲得了一個(gè)包含兩段序列的cDNA開放閱讀框序列,其核苷酸長(zhǎng)度分別為516 bp,命名為GmC2H2.GmC2H2編碼一個(gè)具有172個(gè)氨基酸的蛋白,分子量約19 KD.含有兩個(gè)由21個(gè)氨基酸組成的C2H2保守基序,每個(gè)保守基序都具有

3、植物C2H2型鋅指蛋白特有的QALGGH序列,是一個(gè)典型的C2H2型鋅指蛋白.同時(shí),GmC2H2含有L-Box和DLN-Box等結(jié)構(gòu)序列. RT-PCR半定量分析表明:GmC2H2的表達(dá)受冷、ABA的誘導(dǎo).GmC2H2能夠在大腸桿菌中以GST融合蛋白的形式表達(dá),純化融合蛋白GST::GmC2H2,進(jìn)行凝膠阻滯實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明:GmC2H2鋅指蛋白在體外能與核心序列EPlS(TGACAGTGTCA)有很強(qiáng)的結(jié)合活性,GmC2H2與反

4、向重復(fù)中的一半位點(diǎn)中引入兩個(gè)堿基突變的突變探針結(jié)合活性有所下降,GmC2H2與反向重復(fù)中的兩半位點(diǎn)中都引入兩個(gè)堿基突變的突變探針幾乎沒有結(jié)合活性.說明GmC2H2鋅指蛋白與核心序列EPlS特異性結(jié)合.通過設(shè)計(jì)特異性引物PCR擴(kuò)增及酶切、連接等方法獲得了:1個(gè)缺失第一個(gè)保守域及與第一個(gè)保守域C端順次銜接的7個(gè)氨基酸的突變體(命名為MZF1)、1個(gè)缺失第二個(gè)保守域及與第二個(gè)保守域N端順次銜接的19個(gè)氨基酸的突變體(命名為MZF2)和3個(gè)分別

5、缺失7個(gè)、19個(gè)和26個(gè)氨基酸的不同程度地縮短兩個(gè)保守域之間的距離的GST::GmC2H2融和蛋白突變體(分別順次命名為MZF4、MZF8和MZF10).突變體凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:MZF1和MZF2與核心序列不結(jié)合,氨基酸缺失最少的MZF4與核心序列結(jié)合活性比GmC2H2顯著降低,MZF8和MZF10則幾乎不結(jié)合.說明GmC2H2鋅指蛋白的第一個(gè)保守域及與第一個(gè)保守域C端順次銜接的7個(gè)氨基酸、GmC2H2蛋白第二個(gè)保守域及與第二個(gè)保守

6、域N端銜接的19個(gè)氨基酸對(duì)其與核心序列EPlS的結(jié)合都是必需的,而兩個(gè)保守域之間的氨基酸序列組成則是影響GmC2H2鋅指蛋白與核心序列EPlS的結(jié)合的重要因素.通過將構(gòu)建的GmC2H2基因的雙子葉植物轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體GmC2H2::pCAMBIA和空pCAMBIA載體,借助于農(nóng)桿菌侵染法,轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn),同期轉(zhuǎn)基因型擬南芥的根長(zhǎng)明顯小于對(duì)照,但是側(cè)根數(shù)目似乎比轉(zhuǎn)入空pCAMBIA載體的擬南芥的多,說明該基因可能參與根的發(fā)育.氨基