哈茨木霉TH--33 C2H2型轉(zhuǎn)錄因子THA09974的功能研究.pdf

1、哈茨木霉是一種重要的生防真菌，具有拮抗廣譜性、適應(yīng)性強(qiáng)和多重作用機(jī)制等特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室早期對(duì)哈茨木霉Gα蛋白基因Thga1進(jìn)行了敲除，發(fā)現(xiàn)敲除菌株相對(duì)原始菌株分生孢子梗數(shù)和分生孢子量顯著減少。對(duì)野生型菌株和敲除株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)C2H2型鋅指蛋白類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子THA09974表達(dá)量下調(diào)最大，故對(duì)tha09974進(jìn)行了敲除，獲得了敲除突變體THA09974-，發(fā)現(xiàn)敲除突變體的菌落特性發(fā)生變化。因此，本研究進(jìn)行tha09974回復(fù)，通過(guò)回復(fù)突變

2、株、敲除突變株和野生型三種菌株的特性比較來(lái)探討該轉(zhuǎn)錄因子的功能。取得了如下結(jié)果:
　　1.構(gòu)建了tha09974基因回復(fù)株THA09974+/-
　　將PCR擴(kuò)增得到的Pgpda啟動(dòng)子片段、tha09974基因片段、Ttrpc終止子片段通過(guò)重疊PCR順次拼接形成基因表達(dá)盒，將其通過(guò)infusion酶連接線性化載體pKH-KO-G418得到tha09974基因回復(fù)載體，通過(guò)酶切和PCR驗(yàn)證了載體正確性。將回復(fù)載體pKH-KO-

3、G418-THA09974轉(zhuǎn)化THA09974-獲得回復(fù)株THA09974+/-。通過(guò)PCR和RT-PCR擴(kuò)增驗(yàn)證了目標(biāo)基因，絕對(duì)熒光定量發(fā)現(xiàn)tha09974基因在THA09974+/-中以單拷貝形式存在，證明tha09974基因在THA09974-回復(fù)成功，THA09974+/-構(gòu)建成功。
　　2.tha09974基因?qū)甑纳飳W(xué)特性影響
　　在PDA培養(yǎng)基上的THA09974-菌落形態(tài)顏色更綠;敲除突變株的生長(zhǎng)速度和生

4、物量產(chǎn)量較野生型分別下降30％、50％，產(chǎn)孢量較野生型上升100％; THA09974+/-和野生株生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量無(wú)顯著差異。THA09974-比TH-33果膠酶分泌量高28.9％，THA09974+/-和野生株果膠酶產(chǎn)量無(wú)顯著差異。說(shuō)明tha09974基因?qū)戤a(chǎn)孢和分泌果膠酶有負(fù)調(diào)控作用，對(duì)菌株生長(zhǎng)起正調(diào)控作用。
　　3.tha09974基因?qū)甑目鼓嫘杂绊?br>　　在2.4mM Cu2+濃度下，TH-33、THA099

5、74-、THA09974+/-與0mM Cu2+濃度相比，生物量分別減少50％、15.6％和50％，生長(zhǎng)速度抑制率分別為78％、75％和80.9％，3種菌株都基本不產(chǎn)孢。說(shuō)明tha09974基因在2.4m MCu2+脅迫下，對(duì)菌株生物量可能起正調(diào)控作用，對(duì)菌株產(chǎn)孢和生長(zhǎng)速度影響不大。在5mM H2O2脅迫下，TH-33、THA09974-、THA09974+/-的產(chǎn)孢量較在0mM H2O2濃度下生物量分別減少36.7％、69％和43％，

6、分別減少65％、78.7％和68％，生長(zhǎng)速度抑制率分別達(dá)到67％、39％和90％。說(shuō)明tha09974在H2O2脅迫下可能正調(diào)控菌株的產(chǎn)孢和菌絲生物量，對(duì)菌株菌絲的生長(zhǎng)速度起負(fù)調(diào)控作用。
　　4.tha09974基因?qū)贽卓剐Ч挠绊?br>　　平板拮抗實(shí)驗(yàn)表明tha09974敲除突變株相比于野生型TH-33和THA09974+/-對(duì)立枯絲核菌的抑制作用增強(qiáng)6％，對(duì)3種菌株的纖維素酶產(chǎn)量分別進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)THA09974-纖維