粗糙脈孢菌C2H2突變株篩選及基因功能研究.pdf

1、絲狀真菌的木質(zhì)纖維素水解酶基因在可溶性誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用下表達(dá)，其表達(dá)水平取決于轉(zhuǎn)錄激活子和阻遏因子的共同作用。因此，挖掘、解析這些纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子對提高木質(zhì)纖維素水解酶的產(chǎn)量具有重要的理論指導(dǎo)和實際應(yīng)用意義。
　　為了進(jìn)一步挖掘調(diào)控纖維素酶表達(dá)的新型轉(zhuǎn)錄因子，本研究以粗糙脈孢菌鋅指轉(zhuǎn)錄因子C2H2家族的57株單基因突變體為研究對象，在以2％結(jié)晶纖維素為唯一碳源的培養(yǎng)條件下進(jìn)行篩選，并且對這些突變體的發(fā)酵液中蛋白濃

2、度、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶酶活、外切纖維素酶酶活、β-葡萄糖苷酶酶活及生物量進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，7株突變體的蛋白產(chǎn)量及內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶酶活均比野生型有25％～77％不等的顯著提高，而突變株NCU06487（cea-1）、NCU10006（cea-2）的蛋白產(chǎn)量及內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶酶活均比野生型有65％-80％不等的顯著降低。為了進(jìn)一步研究這兩個轉(zhuǎn)錄因子在纖維素酶表達(dá)過程中的功能，首先，對突變株Δcea-1和Δcea-2

3、進(jìn)行了回補實驗，證實了突變株蛋白和酶活的降低是由這兩個轉(zhuǎn)錄因子基因缺失所引起的。同時，亞細(xì)胞定位實驗顯示這兩個轉(zhuǎn)錄因子均定位于細(xì)胞核中。此外，Δcea-1和Δcea-2在纖維素條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，由于cea-1和cea-2的缺失，大多數(shù)的纖維素酶基因明顯下調(diào)。而且，這兩轉(zhuǎn)錄因子的敲除顯著影響纖維素酶表達(dá)調(diào)控因子(Clr-1、Clr-2)、碳代謝阻遏因子CRE-1等已知重要轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平。在野生型菌株背景下過表達(dá)實驗表明提高cea