小麥抗逆相關(guān)DREB-ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與鑒定.pdf

1、中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文小麥抗逆相關(guān)DREB/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與鑒定姓名：徐兆師申請學位級別：博士專業(yè)：作物遺傳育種指導教師：馬有志20050601激活了E R F 2 的轉(zhuǎn)錄，推測E R F l 和E R F 2 的轉(zhuǎn)錄可能依賴于A B A 的存在。病原菌誘導結(jié)果表明，E R F I 和E R F 2 基因均受白粉病強烈誘導表達。以上結(jié)果表明，_ 些E R F 基因不僅受非生物脅迫的誘導，而且還可能參與了病原菌誘導的信號傳遞

2、。5 ． 基因定位：用中國春缺體．四體為材料，通過S o u t h e r nb l o t 技術(shù)將D R E B 2 基因和E R F l 基因分別定位到7 A ／7 B ／7 D 染色體和7 A ／7 B 染色體上；用特異性引物進行P C R 擴增將E R F 2 基因初步定位到3 D 染色體上。本試驗首次將單子葉植物的A P 2 ／E R E B P 轉(zhuǎn)錄因子定位到特定的染色體上。6 ． 結(jié)合特異性和激活功能分析：凝膠阻滯試驗結(jié)

3、果表明，D R E B 4 和D R E B 5 蛋白在體外能與D R E 順式元件特異結(jié)合，而且D R E 順式元件的核心序列1 c 2 c 3 G 4 A s C 在與D R E B 4 和D R E B 5的互作中，1 C 2 C 可能比3 G 4 A s C 更重要；E R F 2 蛋白在體外能與E R E 順式元件特異結(jié)合，核心序列1 G 2 C 3 C 4 G 5 c 6 c 在與E R F 2 的互作中，4 G , c 6

4、 C 可能比1 G 2 c 3 c 更重要；通過酵母單雜交系統(tǒng)分析體內(nèi)結(jié)合特異性和激活功能，將D R E B 4 和D R E B 5 的e D N A 構(gòu)建到Y(jié) e p G A P 載體上，轉(zhuǎn)化到野生型酵母報道子中，結(jié)果菌株在含有3 ．A T 的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基生長，而且在Z ／X ．g a l溶液中顯色，推測D R E B 4 和D R E B 5 蛋白結(jié)合了D l 也順式元件，并激活了報道基因的轉(zhuǎn)錄表達；而突變體酵母報道子無法生長

5、，也沒有顯色，說明D R E I M 和D R E B 5 蛋白對D R E 順式元件的結(jié)合具有特異性。7 ． 基因功能分析：通過農(nóng)桿菌侵染，將D R E B 4 和E R F I ／2 分別轉(zhuǎn)化到了擬南芥和煙草中，通過基因槍法將D R E B 4 和E R F l ／2 分別轉(zhuǎn)化到了小麥中，并對后代進行了檢測。非生物脅迫抗性鑒定結(jié)果表明，D R E B 4 、E R F l 或E R F 2 的過表達提高了擬南芥對干旱、高鹽或低溫的抗

6、性，例如D R E B 4 轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱、高鹽和低溫脅迫下存活率分別比對照提高了9 0 ％、4 0 ％和5 5 ％；類似地，E R F I 和E R F 2 的轉(zhuǎn)基因擬南芥也提高了對非生物脅迫的抗性；D R E B 4 基因還明顯提高了小麥在1 8 ％P E G 6 0 0 0 條件下的發(fā)芽率；抗病性鑒定結(jié)果表明，E R F 2 的過表達明顯提高了對細菌Ps y r i n g a e 和真菌Ac i n e r e a 的抗性，

7、然而E R F l 的過表達增強了植株對真菌B ．c i n e r e a 的敏感性，這可能與E R F l 的過表達引起植株的形態(tài)變化有關(guān)。綜上所述，本研究克隆了1 0 個D R E B 和2 個E R F 轉(zhuǎn)錄因子基因，并對其分子生物學特性進行了分析，D R E B 4 和E R F l ／2 基因的過表達提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥或小麥抗生物脅迫或非生物脅迫的能力。D R E B 和E R F 轉(zhuǎn)錄因子的克隆為改良作物的抗逆性提供了候選