梭梭熱激轉(zhuǎn)錄因子HaHsfA3、HaHsfB3的克隆、亞細胞定位和表達模式分析.pdf

1、溫度是植物生長的三大必需條件之一，也是影響植物生長、發(fā)育的主要環(huán)境因子。高溫脅迫會對植物生長發(fā)育帶來傷害，培育耐熱品種可以幫助植物更好地應對高溫危害。而熱激轉(zhuǎn)錄家族則是一類對于溫度有敏感響應的轉(zhuǎn)錄家族，它所囊括的熱激轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factor，HSF)具有耐熱、耐干旱等重要抗逆功能。梭梭（Haloxylon ammodendron），別名梭梭柴，是藜科(Chenopodiaceae)梭梭屬（

2、Haloxylon）多年生灌木或小喬木。主要分布在亞非大陸的熱帶及亞熱帶，生長在沙漠，鹽漬地和礫質(zhì)戈壁上，耐風蝕、耐干旱。本試驗以梭梭植株為試驗材料，克隆了2個熱激轉(zhuǎn)錄因子HaHsfA3、HaHsfB3，該基因編碼的蛋白被認為可以提高植物的抗高溫能力。對這兩個梭梭熱激轉(zhuǎn)錄因子進行了生物信息學分析，并研究其編碼蛋白的亞細胞定位。此外，為了研究熱激轉(zhuǎn)錄因子在逆境下的功能，對梭梭進行高低溫處理、干旱脅迫處理，分析其表達模式和生理響應?？傊?，本

3、文從基因、生理水平研究了不同逆境下梭梭根、同化枝的調(diào)控機制。本論文的主要結果如下:
　　1.根據(jù)已測定的梭梭轉(zhuǎn)錄組測序結果，運用生物信息學方法鑒定梭梭熱激轉(zhuǎn)錄因子基因HaHsFs，克隆出了梭梭熱激轉(zhuǎn)錄因子HaHsfA3、HaHsfB3基因，其ORF長度分別為1083 bp和768 bp，編碼361個和256個氨基酸，分子量為39.76 kDa和29.30 kDa，理論等電點為5.38和8.21，aHsfA3和HaHsfB3基因均具

4、有熱激轉(zhuǎn)錄因子特有的DNA結合域，二者編碼的蛋白均為親水性蛋白。構建的同源進化樹表明:梭梭HaHsfA3與茄科HsfA3蛋白進化關系最近，而HaHsfB3與葫蘆科HsfB3蛋白進化關系最近。
　　2.通過Softberry和WOLF PSORT網(wǎng)站預測，結果表明HaHsfA3、HaHsfB3蛋白定位在細胞核。根據(jù)預測結果，本實驗構建了HaHsfA3、HaHsfB3基因的GFP-PA7載體，利用基因槍瞬時表達的亞細胞定位法，發(fā)現(xiàn)Ha

5、HsfA3、HaHsfB3基因編碼的蛋白質(zhì)均定位于細胞核。
　　3.對一月齡梭梭幼苗進行高溫、低溫、干旱脅迫，并在不同時間段取樣，然后進行qRT-PCR分析，結果發(fā)現(xiàn)在不同脅迫下，HaHsfA3和HaHsfB3基因的表達模式有差異。45℃高溫處理下，同化枝中HaHsfA3和HaHsfB3均呈現(xiàn)先上升、后下降的表達趨勢，但Ha HsfA3的表達水平顯著高于HaHsfB3。4℃低溫處理下，同化枝中HaHsfA3和HaHsfB3均呈現(xiàn)先

6、上升、后下降的表達趨勢，這兩個基因的表達均在1h達到最大?？偟膩碚f，Ha HsfB3基因的表達水平高于HaHsfA3。干旱處理下，同化枝中HaHsfA3和HaHsfB3的表達在1h達到最大，明顯高于對照，1h后略高于對照。根中Ha HsfA3和HaHsfB3均明顯的上調(diào)表達，Ha HsfA3先上升，于8h達到最大，然后經(jīng)歷一個下降再上升的過程，48 h的表達量略低于8 h;而HaHsfB3的表達量總體上一直呈現(xiàn)上升趨勢，于48 h達到最

7、大值。上述結果表明，同化枝和根中的HaHsfA3和HaHsfB3分別對高溫、干旱的響應明顯。
　　4.超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxisome，POD)、過氧化氫酶(Hydrogen Peroxidase，CAT)作為抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分，在植物耐旱過程中發(fā)揮著重要的作用。本試驗測定了20％PEG模擬干旱脅迫梭梭幼苗中SOD、POD、CAT等酶活性以及丙二醛(Mal

8、ondialdehyde，MDA)含量，發(fā)現(xiàn)梭梭幼苗中SOD、POD、CAT等酶活性在干旱處理下均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而MDA的含量在4h內(nèi)緩慢升高，而超過4h后急劇上升。這些結果表明:干旱脅迫初期，植物受到的干旱損害并不嚴重，此時植物體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)作用增強，SOD、POD、CAT等酶活性升高，清除活性氧，減輕活性氧對細胞膜等傷害，所以這時作為膜脂過氧化產(chǎn)物的MDA含量僅緩慢升高，維持在一個較低的水平。隨著干旱脅迫的持續(xù)進行，對植