利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與番茄RIN互作蛋白的初步研究.pdf

1、果實(shí)的發(fā)育成熟過程是植物所特有的生命現(xiàn)象,而果實(shí)本身也在人類的飲食結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)供給中占有舉足輕重的地位。因此,這個(gè)特殊的生長發(fā)育過程一直都倍受關(guān)注。近年來,隨著分子和遺傳學(xué)在果實(shí)乙烯合成、乙烯響應(yīng)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控等方面研究的不斷深入,人們果對(duì)實(shí)發(fā)育,尤其是鮮果的成熟機(jī)制有了更深層次的認(rèn)識(shí)。
　　 番茄(Solanum lycopersicum)存在有大量與果實(shí)成熟相關(guān)的突變體,所以一直被認(rèn)為是果實(shí)發(fā)育成熟研究的模式植物。作為眾多突變

2、體的典型,rin突變存于乙烯調(diào)控途徑的上游,并且不受乙烯調(diào)控。最近,人們通過圖位克隆的方法在rin基因位點(diǎn)克隆到了MADS-box類轉(zhuǎn)錄因子RIN,隨即又在草莓這種研究非呼吸躍變成熟途徑的模式植物中發(fā)現(xiàn)了其同源基因。由此推測(cè)RIN可能是兩種不同成熟途徑的果實(shí)中共存的保守調(diào)控因子。本研究通過酵母雙雜交系統(tǒng),篩選與RIN互作的相關(guān)蛋白,進(jìn)行功能分析。不僅可以更好的了解RIN這類轉(zhuǎn)錄因子在復(fù)雜的成熟調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用機(jī)制,更可以讓其在延長貨架和

3、提高果實(shí)品質(zhì)中得到廣泛的應(yīng)用。研究結(jié)果如下:
　　 1.依據(jù)GenBank上的RIN基因信息以及生物信息學(xué)分析,通過RT-PCR的方法分別獲得了全長及亞克隆片段RIN(MIK、IKC、IK和K)。
　　 2.構(gòu)建了基因完整片段和亞克隆片段的pGBKT7釣餌表達(dá)載體,進(jìn)行自激活和毒性檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),各重組釣餌載體均無自激活性,但pGBKT7-RIN和pGBKT7-IKC則對(duì)宿主菌Y187有明顯的毒性抑制現(xiàn)象。
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4、.通過半定量RT-PCR的方法對(duì)PIN基因在番茄AC(Ailsa Craig)幼果、綠熟、破色、粉紅和紅熟發(fā)育時(shí)期果實(shí)mRNA水平的表達(dá)差異進(jìn)行分析。結(jié)果顯示RIN基因在幼果期基本不表達(dá),從綠熟期開始隨著果實(shí)成熟度的增加表達(dá)也隨之增加,在紅熟期達(dá)到最大。
　　 4.以破色、粉紅和紅熟時(shí)期果實(shí)的mRNA的混合樣品為模板,成功分離、純化了果實(shí)成熟期混合的雙鏈cDNA,將其與pGADT7-Rec線性載體共轉(zhuǎn)化酵母宿主菌AH109后,構(gòu)

5、建了酵母雙雜交文庫。對(duì)文庫進(jìn)行插入片段大小檢測(cè),發(fā)現(xiàn)片段在500bp到3kb之間,且多態(tài)性良好。血球計(jì)數(shù)法檢測(cè)文庫滴度為1.2×109cells/ml。
　　 5.用pGBKT7-MIK重組質(zhì)粒作為釣餌對(duì)文庫進(jìn)行mating,得到了約200個(gè)雜交菌斑,結(jié)合效率為1.2％。PCR檢測(cè)后隨機(jī)選取40個(gè)片段進(jìn)行測(cè)序。
　　 6.測(cè)序得到了31個(gè)序列的部分信息,對(duì)序列信息在SGN Uni基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)后,得到了14個(gè)有效