犬細(xì)小病毒NS1非結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的一種急性傳染病。此病主要表現(xiàn)急性出血性腸炎和急性心肌炎,傳染性強(qiáng),發(fā)病率和死亡率高,是一種危害犬,特別是幼犬的一種重要的傳染性疾病。近20多年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)犬細(xì)小病毒病的流行病學(xué)、病原生物學(xué)、診斷和防治方面進(jìn)行了大量研究,但是,目前對(duì)犬細(xì)小病毒病的發(fā)病機(jī)制了解甚少。
　　 已有研究證實(shí),在體外CPV感染貓腎細(xì)胞NLFK和犬纖維瘤細(xì)胞A72可以引起細(xì)胞

2、凋亡,在體內(nèi)CPV感染可誘導(dǎo)腸粘膜上皮細(xì)胞的凋亡和壞死,進(jìn)而引起繼發(fā)感染。為了研究犬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在CPV引起宿主細(xì)胞凋亡中的作用,初步探討CPV引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制,需要表達(dá)NS1蛋白。為獲得具有生物活性的NS1蛋白,我們選用真核表達(dá)系統(tǒng),把重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)NS1蛋白。
　　 本實(shí)驗(yàn)首先參考GenBank已發(fā)表的犬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因的序列,設(shè)計(jì)2對(duì)引物,以犬細(xì)小病毒的基因組為模板,采用PCR方法擴(kuò)增

3、NS1編碼基因,將該基因片段克隆到pcDNA3.1A載體中,構(gòu)建成下游融合6×His的融合表達(dá)載體pcDNA-NS1/His和非融合表達(dá)載體pcDNA-NS1,融合表達(dá)載體pcDNA-NS1/His通過(guò)轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)NS1重組蛋白,用Western-blot檢測(cè)以確定重組NS1蛋白能否在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。然后用CPV感染和用pcDNA-NS1表達(dá)載體轉(zhuǎn)染F81宿主細(xì)胞,通過(guò)AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)磷脂酰絲氨酸

4、外翻和通過(guò)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)caspase-3/7活性,分析感染CPV或轉(zhuǎn)染NS1基因?qū)81宿主細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的NS1基因序列與GenBank的序列一致,構(gòu)建的表達(dá)載體結(jié)構(gòu)正確,并能夠介導(dǎo)NS1基因在真核細(xì)胞中表達(dá)。感染CPV和轉(zhuǎn)染NS1基因均能誘導(dǎo)F81細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻和明顯提高細(xì)胞內(nèi)caspase-3/7的活性,表明CPV和NS1蛋白均能引起細(xì)胞的凋亡。綜上所述,犬細(xì)小病毒的NS1非結(jié)構(gòu)蛋白