狂犬病毒先導(dǎo)RNA及其宿主互作蛋白的功能研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病毒引起的人獸共患傳染病，人與所有的溫血?jiǎng)游锒家赘胁⒖蓚鞑ゲ《?。該病在全球分布廣泛，且一旦發(fā)病，死亡率幾乎為100％，因此給人類健康帶來(lái)巨大的威脅。全球每年有5.9萬(wàn)人因狂犬病死亡，其中有絕大部分發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國(guó)家?？袢《緦儆诳袢《緦?gòu)棤畈《究?，病毒基因組編碼五種結(jié)構(gòu)蛋白，病毒在轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中不僅產(chǎn)生這五種結(jié)構(gòu)蛋白的mRNA，也會(huì)產(chǎn)生一段5'端沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，3'端沒(méi)有polyA尾巴的非編碼RNA，名為先導(dǎo)RNA

2、。
　　有研究用末端標(biāo)記的狂犬病毒基因組與被固定毒感染12小時(shí)的BHK-21細(xì)胞產(chǎn)物做雜交，檢測(cè)到狂犬病毒感染后產(chǎn)生的先導(dǎo)RNA，長(zhǎng)度主要是56 nt和58 nt，其中56 nt的先導(dǎo)RNA的量約是58 nt長(zhǎng)度的兩倍。并且檢測(cè)被固定毒感染24小時(shí)的細(xì)胞時(shí)，結(jié)果相同，但先導(dǎo)RNA的量比感染后12小時(shí)少。該研究中同樣也發(fā)現(xiàn)了先導(dǎo)RNA有其他的長(zhǎng)度，如43 nt、60 nt?？袢《竞退菪钥谘撞《镜暮说鞍锥寄芡ㄟ^(guò)與先導(dǎo)RNA的互作來(lái)

3、影響病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制之間的轉(zhuǎn)換，決定了病毒是以轉(zhuǎn)錄為主還是以復(fù)制為主。在狂犬病毒感染時(shí)，狂犬病毒核蛋白與先導(dǎo)RNA的互作比核蛋白與核蛋白mRNA的互作、核蛋白和其他非病毒RNA的互作都更強(qiáng)，證明與非病毒RNA和病毒的mRNA相比，核蛋白會(huì)優(yōu)先結(jié)合先導(dǎo)RNA。核蛋白和磷蛋白同時(shí)表達(dá)時(shí)，磷蛋白會(huì)使核蛋白結(jié)合其他RNA的能力降低，但不影響核蛋白結(jié)合先導(dǎo)RNA。但是，先導(dǎo)RNA本身的作用以及先導(dǎo)RNA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制并不清楚，本實(shí)驗(yàn)旨在研究先導(dǎo)RN

4、A的產(chǎn)生、功能以及與宿主之間的關(guān)系。
　　以狂犬病毒街毒株DRV-AH08作為研究對(duì)象，來(lái)研究狂犬病毒的先導(dǎo)RNA。DRV-AH08感染小鼠后提取總RNA建先導(dǎo)RNA文庫(kù)，通過(guò)Sanger測(cè)序我們發(fā)現(xiàn)，DRV-AH08的先導(dǎo)RNA形式多樣，但最主要的長(zhǎng)度是64 nt。隨后我們用DRV-AH08感染SK-N-SH細(xì)胞，并在感染早期提取總RNA建先導(dǎo)RNA文庫(kù)，然后做高通量測(cè)序，高通量測(cè)序的結(jié)果顯示先導(dǎo)RNA的主要長(zhǎng)度仍是64 nt。

5、雖然先導(dǎo)RNA長(zhǎng)度不同，但是我們預(yù)測(cè)了56 nt、58 nt和64 nt的先導(dǎo)RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，它們的二級(jí)結(jié)構(gòu)相似。為了進(jìn)一步研究先導(dǎo)RNA的功能，我們利用人類腺病毒表達(dá)載體，在細(xì)胞中和活體中過(guò)表達(dá)先導(dǎo)RNA。首先是細(xì)胞中，用表達(dá)載體過(guò)表達(dá)不同長(zhǎng)度的先導(dǎo)RNA，然后感染不同劑量的狂犬病毒（0.01MOI和0.1MOI）發(fā)現(xiàn)56 nt、58 nt和64 nt長(zhǎng)度的先導(dǎo)RNA均能抑制狂犬病毒的感染，并且我們用體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的64nt先導(dǎo)R

6、NA轉(zhuǎn)染細(xì)胞驗(yàn)證了先導(dǎo)RNA對(duì)狂犬病毒感染的抑制作用。然后我們將過(guò)表達(dá)先導(dǎo)RNA和過(guò)表達(dá)對(duì)照RNA的人類腺病毒通過(guò)腦三維立體定位注射的方式分別注射到同一只小鼠的左右腦海馬區(qū)，再感染狂犬病毒，最后發(fā)現(xiàn)在活體水平過(guò)表達(dá)先導(dǎo)RNA仍然能抑制狂犬病毒的感染。
　　同時(shí)我們也在SK-N-SH細(xì)胞中再次驗(yàn)證了，過(guò)表達(dá)先導(dǎo)RNA時(shí)，狂犬病毒的基因組RNA顯著性減少。通過(guò)RNA免疫共沉淀試驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，先導(dǎo)RNA存在時(shí)，能抑制狂犬病毒核蛋白與基因組

7、RNA結(jié)合。這表明，先導(dǎo)RNA可以通過(guò)抑制核蛋白與基因組結(jié)合來(lái)抑制狂犬病毒的復(fù)制。
　　RNA和蛋白互作試驗(yàn)證實(shí)宿主中的熱休克同源70 KD蛋白，Hsc70，可以與先導(dǎo)RNA互作，并且這種互作是直接的互作。Hsc70和先導(dǎo)RNA互作3D結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果顯示，Hsc70的核酸結(jié)合區(qū)域可能是結(jié)合了先導(dǎo)RNA51 nt-59 nt的AU富集區(qū)。抑制Hsc70的表達(dá)可以促進(jìn)先導(dǎo)RNA的水平升高。同時(shí)Hsc70表達(dá)水平降低，會(huì)導(dǎo)致狂犬病毒的復(fù)制

8、減少。而反過(guò)來(lái)，狂犬病毒感染后也會(huì)影響Hsc70的表達(dá)，狂犬病毒感染后2小時(shí)，Hsc70的水平顯著下降，但是感染后36小時(shí)，Hsc70的水平又顯著升高。這種不同的變化促使我們進(jìn)一步研究了Hsc70、先導(dǎo)RNA和病毒基因組RNA之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)狂犬病毒感染早期會(huì)抑制Hsc70的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致先導(dǎo)RNA含量增加，進(jìn)而抑制了病毒的復(fù)制，而在感染晚期，Hsc70的表達(dá)水平升高，先導(dǎo)RNA含量下降，病毒開(kāi)始大量復(fù)制。這種病毒自我調(diào)節(jié)復(fù)制的現(xiàn)象