狂犬病毒糖蛋白衍生肽引導(dǎo)雙報(bào)告蛋白靶腦轉(zhuǎn)運(yùn)的研究.pdf

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，如老年癡呆癥、帕金森病等嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，給社會(huì)、家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。將具有治療作用的物質(zhì)輸送至腦部、對(duì)腦部疾病進(jìn)行有效地治療，一直是人們期待的目標(biāo)。然而，由于血腦屏障(BBB)的存在，許多有潛在治療價(jià)值的大分子物質(zhì)難以進(jìn)入腦內(nèi)。將這些大分子治療物質(zhì)透過(guò)BBB、靶向轉(zhuǎn)運(yùn)入腦，一直是人們不懈探索的目標(biāo)。目前，開(kāi)發(fā)靶腦載體是解決這個(gè)難題的有效途徑，將具有治療功能的物質(zhì)通過(guò)分子克隆的方法，與靶腦載體連接，在細(xì)胞

2、中表達(dá)形成融合蛋白，在載體的協(xié)助作用下，可實(shí)現(xiàn)大分子物質(zhì)的靶腦轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 狂犬病毒糖蛋白(RVG)是一種嗜神經(jīng)性的蛋白質(zhì)，能夠攜帶其它物質(zhì)向中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)、促進(jìn)其他病毒轉(zhuǎn)運(yùn)到腦中，已證實(shí)位于第189～214位和第330～357位的肽段具有嗜神經(jīng)性，這些肽段是RVG與受體結(jié)合的關(guān)鍵部位，將這些肽段進(jìn)行改造，可得到靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)、無(wú)免疫原性的RVG衍生肽段(RDP)，這種衍生肽保留了RVG的嗜神經(jīng)性，具有將外源物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)入腦的潛

3、在功能。將189-214位與第330-327位多肽片段的基因序列進(jìn)行改造，并分別命名為RDP189與RDP330，本實(shí)驗(yàn)室為了驗(yàn)證RDP的靶腦轉(zhuǎn)運(yùn)大分子蛋白的功能，將RDP189和RDP330的核苷酸片段與雙報(bào)告基因egfp和lacz的核苷酸片段重組，用RDP攜帶大分子雙報(bào)告蛋白β-半乳糖苷酶(β-GAL)和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)入腦轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)構(gòu)建沒(méi)有RDP序列的egfp和lacz重組質(zhì)粒，作為對(duì)照，探究RDP的入腦轉(zhuǎn)運(yùn)能力。<

4、br>　　 通過(guò)分子克隆方法，將載體RDP核苷酸序列與β-GAL和 EGFP的核苷酸序列重組，獲得重組質(zhì)粒pET28(+)-RDP-EGFP-LacZ，同時(shí)構(gòu)建沒(méi)有RDP的β-GAL和EGFP的核苷酸重組質(zhì)粒pET28(+)-EGFP-LacZ，作為對(duì)照。獲得陽(yáng)性克隆后，大腸桿菌體內(nèi)，在25℃，6h，IPTG：1.0mM的條件下進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，超聲破碎的方法，獲得目的蛋白，融合蛋白均為可溶性表達(dá)，無(wú)須包涵體處理。Lorry法測(cè)定總蛋

5、白含量，通過(guò)尾靜脈注射方法注射入小鼠體內(nèi)。小鼠實(shí)驗(yàn)分為三組，實(shí)驗(yàn)組，注射有RDP引導(dǎo)的EGFP和β-GAL融合蛋白，對(duì)照組，注射沒(méi)有RDP引導(dǎo)的EGFP和β-GAL融合蛋白，空白組，不作處理。15min、8h后分別處死小鼠，取組織，固定、脫水、切片，通過(guò)熒光顯微鏡和X-gal染色分別檢測(cè)EGFP和β-GAL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組，在大腦皮層的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和海馬區(qū)的神經(jīng)元以及脊髓灰質(zhì)中，分別檢測(cè)到蛋白的分布，外周組織中，除了腎臟和肝臟，其

6、他外周組織蛋白的分布與空白組相似；對(duì)照組，僅在腎臟和肝臟中檢測(cè)到蛋白的分布，其他各組織蛋白發(fā)布與空白組相似。另外，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的腎臟和肝臟中均檢測(cè)到蛋白的分布，原因是這兩個(gè)器官是主要的排泄和解毒器官，一部分蛋白可能通過(guò)這兩個(gè)器官排泄排出體外。此外，蛋白注射小鼠體內(nèi)15min后，便能在腦部檢測(cè)到蛋白的分布，并且含量較高，說(shuō)明轉(zhuǎn)運(yùn)速率非?？?，提示融合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的可能機(jī)制是通過(guò)受體介導(dǎo)的胞吞作用實(shí)現(xiàn)的。8h后，在實(shí)驗(yàn)組基本上檢測(cè)不到蛋白，說(shuō)