狂犬病毒糖蛋白衍生肽作為新型穿膜肽攜帶熒光素酶的入腦研究.pdf

1、目前,神經(jīng)退行性疾病、腦卒中和腦癌這些疾病相當難治療的原因在于許多藥物無法穿過血腦屏障(blood-brain barrier,BBB),特別是一些已經(jīng)明確了對腦細胞具有神經(jīng)保護作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子更是無法通過BBB。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derired neurotrophic factor,BDNF)已經(jīng)證實能夠減少神經(jīng)元的正常死亡,促進海馬神經(jīng)元,皮層神經(jīng)元的修復(fù)和再生,但是其自身卻難以通過血腦屏障。
　　 是否有

2、一種穿膜肽(cell penetrating peptides,CPPs)既能夠進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)也能作為載體運載大分子蛋白入腦呢?狂犬病毒糖蛋白(rabies virusglycoprotein)已被證實具有攜帶siRNA及EGFP等大分子穿過血腦屏障的能力。
　　 將狂犬病毒糖蛋白衍生肽(peptides derived from rabies virusglycoprotein,RDP)用羅丹明B標記,通過尾靜脈注射入小鼠體

3、內(nèi),分別于15min,5h頸椎脫臼處死小鼠,取腦、脊髓、心、肝、脾等組織,冷凍切片,通過熒光顯微鏡觀察羅丹明B標記的RDP在不同時間點的體內(nèi)分布。
　　 選取狂犬病毒糖蛋白衍生肽189和330多肽片段的基因序列,通過分子克隆的方法,將RDPl89和RDP330的核酸片段分別與螢火蟲熒光素酶(FireflyLuciferase)基因序列重組,得到RDP189-luc,RDP330-luc的重組基因,同時構(gòu)建沒有RDP的熒光素酶重組

4、質(zhì)粒,作為對照。獲得的陽性克隆,轉(zhuǎn)入BL21大腸桿菌菌株后,加入終濃度為1.0 mM/L的IPTG在16℃,210r/m誘導(dǎo)6h,利用超聲破碎的方法,離心獲得目的蛋白,通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測融合蛋白為可溶性表達,并計算目的蛋白表達量。
　　 Folin-酚法測總蛋白含量,熒光素酶檢測試劑盒檢測目的蛋白的活性后通過尾靜脈注射方法為小鼠給藥。隨機將健康昆明小鼠分為四組:第一組為空白對照組,注射生理鹽水;第二組注射不含RDP

5、的重組熒光素酶;第三組注射含有RDP189-luc的重組蛋白;第四組注射RDP330-luc的重組蛋白。15min,30min,1h,5h處死小鼠,取中樞神經(jīng)組織,勻漿后檢測熒光素酶活性及蛋白含量。
　　 實驗結(jié)果表明,尾靜脈給藥15min后,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中觀察到羅丹明B標記的RDP片段發(fā)出的紅光,分布于神經(jīng)元細胞與神經(jīng)膠質(zhì)細胞,而在外周組織中的分布與對照組相似,這說明RDP能夠透過血腦屏障快速入腦,并且主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)

6、。
　　 在RDP攜帶熒光素酶入腦實驗中,15min時已在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中均檢測到較高的熒光素酶活性,這說明RDP能夠快速的通過血腦屏障,具有很強的嗜神經(jīng)性,RDP330肽段攜帶熒光素酶活性海馬區(qū)高于皮層,而RDP189融合蛋白活性皮層高于海馬區(qū)。5h后熒光素酶活性與對照組相似,說明融合蛋白能夠快速被生物體降解,具有很高的生物安全性。通過以上實驗結(jié)果說明RDP能夠攜帶熒光素酶這種蛋白大分子快速入腦,不同的RDP融合蛋白在腦內(nèi)的分布