偽狂犬病毒lncRNA轉(zhuǎn)錄組測序和lncRNA在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）是一類長度大于200 bp且不具有編碼功能的轉(zhuǎn)錄本。在真核細(xì)胞中，長鏈非編碼RNA的主要通過以下幾種方式實(shí)現(xiàn)其功能:作為誘餌阻止蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)與其相對應(yīng)的底物結(jié)合;作為骨架與其他物質(zhì)形成相關(guān)的復(fù)合物;作為向?qū)⑾嚓P(guān)的物質(zhì)定位到細(xì)胞中特定的位置。通過這些調(diào)控方式，長鏈非編碼RNA參與真核生物細(xì)胞的復(fù)制、生長、分化、凋亡等過程，從而影響生物個(gè)體的生長發(fā)育、表觀遺傳、免

2、疫反應(yīng)和自身相關(guān)的疾病。
　　偽狂犬病毒(Psedorabies virus，PRV)是皰疹病毒科α皰疹病毒亞科的成員之一。每年該病毒的感染給世界生豬養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。PRV在感染天然宿主時(shí)具有噬神經(jīng)性和潛伏感染性。當(dāng)PRV在宿主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中建立潛伏感染時(shí)，病毒在基因ep0和ie180之間的DNA序列編碼了數(shù)條潛伏感染相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本（Latency associated transcripts，LATs），這些潛伏感染相

3、關(guān)的轉(zhuǎn)錄本都屬于lncRNA，且在PRV感染的上皮細(xì)胞中部分潛伏感染相關(guān)的lncRNA能夠以較低的豐度表達(dá)。因此，PRV感染上皮細(xì)胞時(shí)可能編碼未知的lncRNA，且這些lncRNA可能在病毒的感染、復(fù)制、神經(jīng)細(xì)胞侵入和潛伏感染等過程中發(fā)揮重要的功能。
　　大部分lncRNA與真核生物的mRNA結(jié)構(gòu)相似，都具有5'端的帽子結(jié)構(gòu)和3'端的ploy(A)結(jié)構(gòu)，但有部分lncRNA不具有ploy(A)結(jié)構(gòu)。因此，在鏈特異性文庫構(gòu)建過程中，

4、為了盡量獲得病毒編碼的各種RNA，我們用隨機(jī)引物代替oligo-dT對RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用高通量測序技術(shù)對文庫進(jìn)行測序，同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)方法分析病毒和宿主表達(dá)的lncRNA。隨后通過northern blot、RT-PCR和3'RACE驗(yàn)證病毒和宿主編碼的lncRNA，并且利用序列比對和RT-CR證明PRV編碼的lncRNA在不同毒株之間具有保守性。此外，當(dāng)PRV感染雞原代背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG

5、)細(xì)胞時(shí)，病毒編碼的lncRNA能夠在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。而且病毒感染的時(shí)間、感染劑量和細(xì)胞的培養(yǎng)方式都能影響PRV編碼的lncRNA在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)。在上皮細(xì)胞中，我們利用siRNA干擾病毒lncRNA的表達(dá)，結(jié)果表明部分lncRNA能夠抑制病毒的復(fù)制。因此，該研究能夠?yàn)閘ncRNA在PRV潛伏感染過程中的功能提供理論基礎(chǔ)和新的思路。本研究的主要工作內(nèi)容如下:
　　1.PRV lncRNA轉(zhuǎn)錄組測序及分析
　　PRV以1 M

6、OI的劑量感染PK-15細(xì)胞，24 h后提取細(xì)胞的總RNA，同時(shí)對提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。隨后構(gòu)建鏈特異性文庫，利用Illumina Hiseq2500測序平臺對文庫進(jìn)行測序。隨后去掉測序數(shù)據(jù)中質(zhì)量較低的數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)方法分析病毒和宿主編碼的lncRNA。我們總共鑒定了28262個(gè)lncRNA，其中發(fā)現(xiàn)3條病毒編碼的lncRNA，其余的28259條lncRNA均為宿主自身編碼的lncRNA。在宿主編碼的lncRNA中，28224

7、條lncRNA是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，剩余的35條lncRNA已經(jīng)被報(bào)道。
　　2.LncRNA的鑒定
　　首先將PRV Ea株病毒感染PK-15細(xì)胞，利用RT-PCR分別驗(yàn)證病毒和宿主編碼的lncRNA。同時(shí)利用RT-PCR驗(yàn)證PRV編碼的lncRNA在PRV Bartha株、HNX株和SMX株之間具有保守性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證病毒和宿主編碼的lncRNA，我們利用northern blot檢測到1條病毒編碼的lncRNA以及

8、利用3'RACE獲得1條病毒編碼的lncRNA的3味端序列。
　　3.PRV編碼的lncRNA在神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)
　　我們選取10日齡的SPF雞胚分離雞胚DRG神經(jīng)細(xì)胞，并將細(xì)胞分別接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿和微流體中，細(xì)胞培養(yǎng)至一個(gè)星期時(shí)即可獲得成熟的神經(jīng)細(xì)胞。為了驗(yàn)證PRV編碼的lncRNA是否能夠在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，我們用PRV Ea株病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)皿中的成熟的神經(jīng)細(xì)胞，RT-PCR和qPCR結(jié)果顯示PRV編碼的3條lncRNA

9、能夠在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，且病毒感染的時(shí)間和劑量能夠影響病毒lncRNA的表達(dá)。對于培養(yǎng)在微流體中的神經(jīng)細(xì)胞，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞成熟后，我們向神經(jīng)細(xì)胞的軸突端接種PK-15細(xì)胞，構(gòu)建PRV神經(jīng)細(xì)胞入侵模型和PRV激活感染狀態(tài)時(shí)上皮細(xì)胞入侵模型。RT-PCR和qPCR結(jié)果表明不同培養(yǎng)方式的細(xì)胞能夠影響病毒lncRNA的表達(dá)。
　　4.PRV編碼的lncRNA對病毒復(fù)制的影響
　　根據(jù)病毒lncRNA的序列，我們分別設(shè)計(jì)相應(yīng)的siRNA干擾

10、病毒編碼的lncRNA在PK-15細(xì)胞中的表達(dá)。通過對干擾后的病毒滴度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)2條病毒編碼的lncRNA被siRNA干擾后顯著性地促進(jìn)病毒的復(fù)制。
　　總的來說，我們的研究結(jié)果揭示在PRV感染宿主細(xì)胞的過程中，病毒自身除了能夠編碼lncRNA外，同時(shí)還能夠引起宿主細(xì)胞lncRNA的表達(dá)。病毒編碼的lncRNA在神經(jīng)細(xì)胞中同樣具有較高的表達(dá)豐度，而且在不同培養(yǎng)方式的神經(jīng)細(xì)胞中，病毒編碼的lncRNA的表達(dá)量也不同。部分病毒自身