急性重度失血性休克條件下大鼠血漿和肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)的研究.pdf

1、本文通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，研究在急性重度失血性休克(acute severehemorrhagic shock，ASHS)條件下以及給予ACTH作為干涉條件治療后，大鼠血漿蛋白質(zhì)組及肝臟蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，并初步鑒定和分析差異表達(dá)蛋白質(zhì)的功能，以及它們在失血性休克發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用，以期從蛋白質(zhì)整體水平上探討失血性休克的生理病理機(jī)制，找出失血性休克診斷的新靶標(biāo)和治療的新方法。 ASHS大鼠模型的建立和ACTH抗失血性休克作用

2、的研究。ASHS大鼠模型：手術(shù)后讓大鼠在手術(shù)臺上靜躺10 min，模型0-15min快速失血使平均動脈壓降至35 mmHg，隨后15 min調(diào)整失血量使血壓維持在這一水平，血壓35-45mmHg平臺期50 min，失血量為總血量的40-45％，模型80 min時處死大鼠。通過檢測正常對照組(sham hemorrhage shock，SHS)(n=10)和ASHS組(n=10)大鼠血漿中SOD、MDA、AST、ALT、GSrr、LDH和

3、TNF-α等生化指標(biāo)及觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué)改變和HSP70的含量變化，表明建立的ASHS模型穩(wěn)定性好，符合ASHS的要求，可以作為ASHS的動物模型。在模型50 min時，ACTH組(n=10)在1 min內(nèi)以3 ug·kg<'-1>靜脈注射ACTH；NS組(n=10)靜脈注射ACTH的等體積數(shù)的生理鹽水。通過觀察大鼠的存活時間及以上各項(xiàng)指標(biāo)及形態(tài)學(xué)的變化表明ACTH對ASHS有一定的救治效果。在本節(jié)實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)血漿中SOD活性和MDA

4、含量的變化與目前報(bào)道認(rèn)為二者總是負(fù)相關(guān)變化不一致，在ASHS時二者的變化是正相關(guān)的，即均呈逐漸上升趨勢。 ASHS大鼠血漿蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析由于血漿中白蛋白、IgG、α1-抗胰糖蛋白和α2-巨球蛋白等高豐度的蛋白的含量占80％，嚴(yán)重影響2-DE中低豐度蛋白的分離和鑒定，所以在本節(jié)實(shí)驗(yàn)2-DE前預(yù)先去除了這類高豐度蛋白中的大部分。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SHS組、ASHS組和ACTH組去除高豐度蛋白的血漿的2-DE圖譜分別平均識別到570±0.88、

5、578±1.45和1578±0.88個有意義的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。SHS組與ASHS組兩膠進(jìn)行蛋白點(diǎn)匹配，匹配了493對，匹配率為85.4％；ASHS組與ACTH組兩膠進(jìn)行蛋白點(diǎn)匹配，匹配了493對，匹配率為85.2％。在SHS組和ASHS組去除高豐度蛋白的血漿2-DE凝膠圖譜中共發(fā)現(xiàn)8個差異有意義的蛋白質(zhì)點(diǎn)，通過MALDI-TOF-MS鑒定出了7個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)共3類蛋白(白蛋白、甲狀腺激素結(jié)合蛋白-D鏈蛋白和信號素-3D前體)。ACTH治療后發(fā)

6、現(xiàn)8個斑點(diǎn)中有5個發(fā)生了顯著性差異表達(dá)，鑒定出4個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)共2類蛋白(白蛋白和信號素-3D前體)。 ASHS大鼠肝臟總蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析SHS組、ASH組和ACTH組肝臟組織總蛋白質(zhì)的2-DE圖譜分別平均識別到698±11、700±13和1696±18個有意義的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。SHS組與ASHS組兩膠進(jìn)行蛋白點(diǎn)匹配，匹配了641對，匹配率為91.7％；ASHS組與ACTH組兩膠進(jìn)行蛋白點(diǎn)匹配，匹配了637對，匹配率為91.3％。S

7、HS組與ASHS組肝臟總蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)并鑒定出10個差異顯著的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，共8種蛋白{腫瘤抑制性抗原gp96、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白58(glucose regulatedprotein，58 kDa，GRP58)、ATP合成酶β亞單位、二磷酸果糖酶B、三磷酸甘油醛脫氫酶、谷光苷肽轉(zhuǎn)移酶、過氧還蛋白Ⅰ和細(xì)胞色素B5 }。ACTH治療后發(fā)現(xiàn)并鑒定出2個顯著性差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(腫瘤抑制性抗原gp96和GRP58)。 GRP58在AS

8、HS中的初步研究GRP58是發(fā)現(xiàn)的7個表達(dá)差異有顯著性的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)中肽段匹配分值最高(224)，氨基酸序列覆蓋率最高(41％)的蛋白。對其進(jìn)行Western-blot、MALDI-TOF-MS、免疫熒光組化及RT-PCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在ASHS時，GRP58發(fā)生了150位絲氨酸殘基的去磷酸化。給予ACTH治療后，150位絲氨酸殘基又向磷酸化方向變化。 綜上研究結(jié)果表明，本研究發(fā)現(xiàn)在ASHS時，血漿中SOD活性與MDA含量的變化均