zkscan3基因敲除小鼠模型的研究和EGFR分子轉(zhuǎn)磷酸化機(jī)理的研究.pdf

1、本文對(duì)zkscan3基因敲除小鼠模型的研究和EGFR分子轉(zhuǎn)磷酸化機(jī)理進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：
　　目的：ZKSCAN3(人源)是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子,前期研究發(fā)現(xiàn)該基因在結(jié)腸癌的形成過(guò)程中起著一定的作用,ZKSCAN3在侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞和其肝臟轉(zhuǎn)移病灶中過(guò)度表達(dá),但在鄰近的非轉(zhuǎn)化組織中表達(dá)程度很低,但是,至今為止還沒(méi)有系統(tǒng)的ZKSCAN3基因正常生理功能研究的報(bào)告,鑒于其在自噬、腫瘤病理生物學(xué)中的重要

2、作用,通過(guò)zkscan3(鼠源)基因敲除小鼠模型來(lái)確定其正常的生理功能就具有十分重要的意義。
　　方法：⑴通過(guò)CRE雜交系統(tǒng)敲除野生型小鼠的zkscan3基因的2號(hào)外顯子,并對(duì)敲除小鼠的后代做基因型鑒定。⑵采用RT-PCR方法半定量zkscan3基因在野生型小鼠各個(gè)器官的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究做好前期準(zhǔn)備。⑶定量PCR,使用定量PCR進(jìn)一步對(duì)zkscan3的敲除結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)使用定量精確分析zkscan3在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞以

3、及成年小鼠各個(gè)器官中的表達(dá)情況。⑷使用流式細(xì)胞分析技術(shù)分析成年野生型小鼠和zkscan3敲除小鼠胸腺CD3+細(xì)胞及脾臟中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞百分比含量的差別。⑸分別用zkscan3敲除小鼠和野生型小鼠的CDNA進(jìn)行 Microarray分析,找出與zkscan3功能相關(guān)的基因。⑹對(duì)小鼠進(jìn)行人工抗原卡介苗刺激,檢測(cè)小鼠體內(nèi)免疫應(yīng)答曲線,并檢測(cè)小鼠血液指標(biāo)。
　　結(jié)果：①對(duì)雜交新生小鼠的基因鑒定結(jié)果顯示,zkscan3基因

4、的2號(hào)外顯子確實(shí)被敲除。②對(duì)小鼠各個(gè)器官進(jìn)行 RT-PCR結(jié)果顯示,zkscan3在小鼠不同器官中表達(dá)存在明顯差異,尤其在卵巢、睪丸以及胸腺中高表達(dá)。③定量PCR結(jié)果顯示,zkscan3基因2號(hào)外顯子確實(shí)被敲除;而且zkscan3基因在野生型小鼠的不同器官中存在差異性表達(dá),尤其在胃、卵巢、脾臟、前列腺和脾臟中高表達(dá)。④流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),敲除小鼠胸腺中CD3+淋巴細(xì)胞數(shù)量上比在野生型小鼠中有顯著的升高;同時(shí)在脾臟中,CD4+淋巴細(xì)胞和CD

5、8+淋巴細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量也比在野生型有顯著升高。⑤Microarray結(jié)果顯示,敲除zkscan3后,表達(dá)發(fā)生顯著變化的基因主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)。⑥對(duì)小鼠進(jìn)行抗原免疫刺激后,發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,zkscan3基因敲除小鼠的免疫應(yīng)答出現(xiàn)紊亂,血液檢測(cè)指數(shù)顯示,zkscan3基因敲除小鼠小鼠可能出現(xiàn)貧血癥狀。
　　結(jié)論：研究結(jié)果顯示,zkscan3基因在小鼠體內(nèi)可能是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控基因,根據(jù)已有數(shù)據(jù)推斷,zksca

6、n3很可能對(duì)免疫系統(tǒng)起到抑制的作用,在小鼠體內(nèi)我們發(fā)現(xiàn),它的敲除會(huì)導(dǎo)致小鼠免疫功能的上升,并且會(huì)造成免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)抗原刺激的免疫應(yīng)答紊亂,同時(shí)也會(huì)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。
　　第二部分：
　　目的：表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR),一個(gè)眾所周知的致癌蛋白,在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期和許多癌癥疾病中起著重要的作用。雖然表皮生長(zhǎng)因子受體的二聚化被認(rèn)為是表皮生長(zhǎng)因子受體激活的一個(gè)主要途徑,但是有關(guān)表皮生長(zhǎng)因子受體被激活之后,表皮生長(zhǎng)

7、因子受體之間如何相互作用進(jìn)行轉(zhuǎn)磷酸化以及自身磷酸化仍然不為所知。所以進(jìn)一步研究EGFR在Y845位轉(zhuǎn)磷酸化作用以及其自身磷酸化激酶活性將為EGFR活化及功能調(diào)節(jié)機(jī)制提供新的見(jiàn)解。
　　方法：⑴免疫沉淀和免疫印跡；⑵體外激酶實(shí)驗(yàn)；⑶體外轉(zhuǎn)磷酸化實(shí)驗(yàn)；⑷轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)EGFR細(xì)胞株的建立；⑸細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)；⑹體外DNA摻入實(shí)驗(yàn)。
　　結(jié)果：EGFR分子845位的酪氨酸轉(zhuǎn)磷酸化會(huì)影響其自身自磷酸化；EGFR分子845位的酪氨酸突變后

8、,轉(zhuǎn)磷酸化作用缺陷的分子激酶活性消失；EGFR分子845位酪氨酸突變后,對(duì)其二聚體的磷酸化作用消失；EGFR分子845位酪氨酸突變后,其刺激細(xì)胞生長(zhǎng)和DNA合成的能力下降。
　　結(jié)論：表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR,其845位酪氨酸的轉(zhuǎn)磷酸化作用與表皮生長(zhǎng)因子受體的子磷酸化作用以及激酶活性有關(guān)。當(dāng)將表皮生長(zhǎng)因子受體845位的酪氨酸替換為苯丙氨酸后,它對(duì)配體刺激作用的生物學(xué)反應(yīng)消失,這說(shuō)明了這一轉(zhuǎn)磷酸化位點(diǎn)對(duì)其功能的重要性。所以,我們的研