CCK-,8-刺激小鼠神經(jīng)元EGFR磷酸化的動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、目的：本研究擬采用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫印跡等方法，觀察八肽膽囊收縮素(octopeptide-cholecystokinin，CCK8)刺激小鼠神經(jīng)元后，表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)磷酸化水平的改變，并分析CCK8刺激神經(jīng)元不同時(shí)間點(diǎn)，EGFR磷酸化的動(dòng)力學(xué)特征，以獲得CCK8與EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑交叉對(duì)話(cross talk)的相關(guān)信息。 方法： 1、體外培養(yǎng)

2、小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元。取出生1～2d的乳小鼠大腦皮質(zhì)，經(jīng)胰蛋白酶消化分離后，加入DMEM-F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，24h后改用神經(jīng)元培養(yǎng)基Neurol Medium和B27培養(yǎng)，5～7d后可獲得形態(tài)典型、高密度的神經(jīng)元。 2、用神經(jīng)特異性烯醇化酶(neurone specific enolase，NSE)免疫組織化學(xué)方法對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。待細(xì)胞生長(zhǎng)至第7d，將其固定、封閉后加入一抗NSE、生物素化山羊抗小鼠IgG二抗結(jié)合，用DAB顯色后顯微

3、鏡下觀察結(jié)果并拍照。 3、CCK8、EGF刺激后，神經(jīng)元EGFR磷酸化狀態(tài)分析。將培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別采用CCK8(10-7mol/L)、EGF(40ng/ml)、CCK8(10-7mol/L)+EGF(40ng/ml)刺激神經(jīng)元，對(duì)照組采用等量培養(yǎng)基，刺激5min后裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，用抗磷酸化EGFR抗體進(jìn)行免疫印跡，用Qutity One軟件對(duì)免疫印跡結(jié)果圖象進(jìn)行灰度

4、掃描，以β-action蛋白作為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并分析組間結(jié)果是否存在差異。 4、CCK8刺激EGFR磷酸化的動(dòng)力學(xué)分析。CCK8(10-7mol/L)刺激神經(jīng)元不同時(shí)間(0、3、5、10、30min)后，液氮中止反應(yīng)，裂解細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，按上述方法進(jìn)行EGFR的磷酸化分析，比較各個(gè)時(shí)間點(diǎn)磷酸化水平的改變，并繪制時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線。 結(jié)果： 1、Neurol Medium和B27培養(yǎng)基中因有多種生長(zhǎng)因子，可選擇性

5、的促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)，抑制膠質(zhì)生長(zhǎng)，用其培養(yǎng)的新生鼠大腦皮質(zhì)5-7d后在顯微鏡下可見形態(tài)典型、生長(zhǎng)良好、密度高、較為純化的神經(jīng)元。 2、對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞采用神經(jīng)元標(biāo)志物烯醇化酶(NSE)進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定，結(jié)果顯示大多數(shù)細(xì)胞染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，可以確定為神經(jīng)元。 3、神經(jīng)元提取蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，可見譜帶整齊，沒有拖尾和彌散，在分子量170KD處可見清晰的EGFR譜帶，免疫印跡后可以得到清晰的磷酸化EGFR譜帶，

6、表明本研究所建立的小鼠神經(jīng)元磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法是成功的。 4、分別用CCK8、EGF、CCK8+EGF刺激神經(jīng)元后，免疫印跡分析結(jié)果顯示上述不同刺激后EGFR磷酸化水平存在差異(P<0.05)，與對(duì)照組比較，CCK8、EGF分別刺激后EGFR的磷酸化水平均增強(qiáng)，但是CCK8+EGF刺激后則更為顯著，表明CCK8可刺激EGFR的磷酸化，且存在和EGF的協(xié)同作用。 5、CCK8刺激神經(jīng)元0、3、5、10、30min后得到

7、EGFR磷酸化水平的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線呈峰型，5min達(dá)到最高，之后開始下降，30min時(shí)曲線又有輕微地上揚(yáng)，表明CCK8刺激EGFR磷酸化可能存在快速和遲發(fā)的不同機(jī)制。 結(jié)論： 1、本研究成功地建立了小鼠神經(jīng)元EGF受體磷酸化的免疫印跡分析方法； 2、CCK8可導(dǎo)致神經(jīng)元中EGFR磷酸化水平改變，表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中CCK8與EGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之間存在cross talk，這種不同信號(hào)分子之間的相互交流可能成為CCK