MLCK的PKA磷酸化位點(diǎn)在IL-8誘導(dǎo)的VSMCs增殖和遷移中的作用.pdf

1、根據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年的實(shí)況報(bào)道，每年死于心血管疾病的人數(shù)多于其他任何死因。我國(guó)是心血管疾病高發(fā)國(guó)家，心血管疾病占我國(guó)每年總死亡病因的51％，因此，對(duì)心血管疾病的研究刻不容緩。心血管疾病通常都與動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生密切相關(guān)，而動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展與一些炎性因子的介入密不可分。
　　白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL-8)，是一種趨化性細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)炎癥細(xì)胞趨化，此外I

2、L-8有促進(jìn)有絲分裂的作用，能夠直接引起細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)IL-8能夠促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和遷移，在AS的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。鑒于IL-8介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制尚未完全闡明，因此有必要對(duì)此進(jìn)行深入的研究。
　　肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)是一種與細(xì)胞收縮相關(guān)的關(guān)鍵酶。作為一種多功能域蛋白

3、質(zhì)，MLCK能夠激活其下游的肌球蛋白輕鏈(Myosin light Chain，MLC)，引起細(xì)胞收縮。同時(shí)MLCK也可被多種其他激酶如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、Rho等磷酸化，從而調(diào)節(jié)其活性最終影響細(xì)胞功能。上述MLCK分子的激酶結(jié)合位點(diǎn)對(duì)MLCK功能的發(fā)揮具有不同的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)不斷有研究報(bào)道MLCK與動(dòng)脈粥樣硬化的形成具有密切聯(lián)系，但MLCK分

4、子哪些激酶結(jié)合位點(diǎn)在平滑肌細(xì)胞增殖和遷移過(guò)程中發(fā)揮作用還未見報(bào)道。
　　目的:通過(guò)在豚鼠腦基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(GbaSM-4)中過(guò)表達(dá)MLCK，探索MLCK在平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用，并構(gòu)建MLCK的PKA位點(diǎn)模擬磷酸化和去磷酸化突變的真核表達(dá)載體，通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)探索MLCK的PKA磷酸化位點(diǎn)在IL-8誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移中的作用及相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制。
　　方法:(1)細(xì)胞系:本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為豚鼠腦基底動(dòng)脈

5、平滑肌細(xì)胞GbaSM-4及MLCK表達(dá)敲低的MLCK-/Gba細(xì)胞;(2)表達(dá)載體:本實(shí)驗(yàn)所用到的表達(dá)載體包括MLCK真核表達(dá)載體pCDNA3.1+-Flag-MLCK(簡(jiǎn)稱pCDNA3.1+-MLCK)、MLCK的PKA位點(diǎn)模擬磷酸化突變體pCDNA3.1+-Flag-MLCK-S993D(簡(jiǎn)稱MLCK-S993D)， MLCK的 PKA位點(diǎn)模擬去磷酸化突變體pCDNA3.1+-Flag-MLCK-S993A(簡(jiǎn)稱MLCK-S993A

6、);(3)通過(guò)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將pCDNA3.1+-MLCK轉(zhuǎn)入GbaSM-4細(xì)胞中，使其過(guò)表達(dá)MLCK，研究MLCK對(duì)GbaSM-4細(xì)胞增殖、遷移能力的影響;同樣的方法將MLCK-S993D、MLCK-S993A轉(zhuǎn)入MLCK-/Gba細(xì)胞中，使其分別表達(dá)PKA位點(diǎn)模擬磷酸化和去磷酸化突變的MLCK分子，研究PKA位點(diǎn)不同磷酸化狀態(tài)對(duì)MLCK分子功能的影響;(4)用CCK-8的方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況;(5)用Boyden Chamber法檢測(cè)

7、細(xì)胞的遷移情況;(6)利用RT-PCR方法檢測(cè)與細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)情況，如:PCNA、CyclinD1、α-SMA;(7)用Western blot方法檢測(cè)MLCK、α-SMA、p-ERK等蛋白的表達(dá)情況;(8)用明膠酶譜方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP2的活性;(9)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)20ng/mL IL-8刺激GbaSM-4細(xì)胞24h后，能

8、夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移能力，過(guò)表達(dá)MLCK分子也能夠增強(qiáng)GbaSM-4細(xì)胞增殖、遷移能力;(2)采用定點(diǎn)突變的方法，成功構(gòu)建了MLCK分子PKA位點(diǎn)去磷酸化突變的真核表達(dá)載體MLCK-S993A，pCDNA3.1+-MLCK、MLCK-S993D由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建;(3)在20ng/mL IL-8誘導(dǎo)作用下，MLCK的PKA位點(diǎn)磷酸化與去磷酸化突變均不影響GbaSM-4細(xì)胞增殖作用;(4)在20ng/mL IL-8誘導(dǎo)作用下，MLCK分子

9、的PKA位點(diǎn)模擬磷酸化能夠促進(jìn)GbaSM-4細(xì)胞遷移作用，模擬去磷酸化能抑制GbaSM-4細(xì)胞遷移作用;(5)當(dāng)MLCK分子的PKA位點(diǎn)去磷酸化突變后，GbaSM-4細(xì)胞的p-ERK表達(dá)量降低。
　　結(jié)論:1.IL-8能夠促進(jìn)GbaSM-4細(xì)胞的增殖和遷移作用，這種促進(jìn)作用可能與上調(diào)MLCK的表達(dá)量相關(guān)。
　　2.MLCK的PKA磷酸化位點(diǎn)與IL-8誘導(dǎo)的GbaSM-4細(xì)胞增殖關(guān)系不明顯。
　　3.MLCK的PKA磷酸