DNA損傷誘導(dǎo)Artemis的磷酸化在G2-M Checkpoint Recovery中的作用.pdf

1、Artemis是首先通過連鎖分析的方法分離得到.在放射線敏感的人類重癥聯(lián)合免疫缺陷病 (RS-SCID) 的病人中,Adrtemis 發(fā)生突變或缺失,該病的主要特征是由于V(D)J重排缺陷導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞成熟障礙<'[8]>.生物化學(xué)研究發(fā)現(xiàn),Artemis具有5'-3'外切核酸酶的活性,當(dāng)其與DNA-PKcs形成復(fù)合物并被DNA-PK所磷酸化,其活性發(fā)生轉(zhuǎn)化,由原先的外切核酸酶轉(zhuǎn)變?yōu)閮?nèi)切核酸酶,對發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA和5'端或3

2、'端的突出具有切割作用<'[16]>.在T細(xì)胞抗原受體(TCR)和免疫球蛋白的成熟過程中須要發(fā)生V(D)J重排,在這一過程中,重組酶RAGl和RAG2復(fù)合物識別位于V區(qū)、D區(qū)和J片段側(cè)翼的重組信號識別序列并進(jìn)行切割,形成一個具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的編碼聯(lián)接(coding ioint),而Artemis與DNA-PKcs形成復(fù)合物將這一發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,從而在DNA修復(fù)體系的作用下完成V(D)J重排<'[16]>.Riballo<'[17]和Ma<'[

3、16,18]>等報道,Artemis 參與了非同源性末端連接(NHEJ),對雙鏈斷裂的DNA進(jìn)行修復(fù),且Artemis這一功能需要ATM和/或DNA-PK對其的激活.Zhang等<'[19]>研究發(fā)現(xiàn),Artemis參與了對細(xì)胞周期的調(diào)控,當(dāng)缺乏 Artemis的人類腫瘤細(xì)胞受到DNA損傷后,細(xì)胞的G2/M阻滯明顯縮短.先前的研究表明Artemis蛋白在體外和體內(nèi)均能被DNA-PK、ATM和ATR 所磷酸化<'[16-17,19-23]

4、>.不同的DNA損傷會導(dǎo)致不同的激酶參與對Artemis的磷酸化,當(dāng)細(xì)胞受到離子輻射(IR)后,DNA-PK和ATM參與對Artemis的磷酸化,而在紫外線刺激后則由ATR對Artemis進(jìn)行磷酸化<'[19]>.但是DNA損傷誘導(dǎo)Artemis的磷酸化的詳細(xì)情況以及Artemis的磷酸化在DNA損傷后的細(xì)胞應(yīng)答中的作用目前均未闡明.為此,本課題試圖回答這些問題并將研究結(jié)果報告如下: 1.Artemis蛋白的磷酸化位點及相應(yīng)激酶

5、的鑒定 在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)GST-Artemis并用IR處理細(xì)胞,然后用GST柱子將GST-Artemis純化并進(jìn)行質(zhì)譜分析.發(fā)現(xiàn)在IR處理后,Artemis第516位絲氨酸(S516)被磷酸化,這是一個SQ位點.Artemis蛋白的SCD結(jié)構(gòu)域中除了SQ516外,還有6個SQ位點,分別為SQ534,SQ538,SQ548,SQ553,SQ562和SQ645. 本課題通過定點突變的方法分別將這些SQ位點的絲氨

6、酸(S)突變成丙氨酸(A),然后將這些突變的Artemis與GST融合并在HEK293細(xì)胞中表達(dá),用蛋白凝膠電泳遷移試驗進(jìn)行分析.結(jié)果顯示:在IR處理后,S645A突變體蛋白及S534AS538A聯(lián)合突變體的遷移速率均較野生型的Artemis蛋白快.然后分別合成針對S516、S534、S538和S645四個位點的磷酸化特異性抗體并進(jìn)行Western blot分析,進(jìn)一步證實在IR處理后,Artemis蛋白中的S516、S534、S538

7、和S645四個位點發(fā)生磷酸化.SQ位點是PIKK激酶家族的識別序列,故本課題首先用PIKK激酶的特異性化學(xué)抑制劑caffeine(caffeine能夠抑制ATM和ATR,但不能抑制DNA-PK)和wortmannin(wortmannin能夠抑制ATM、ATR和DNA-PK)處理HEK293細(xì)胞.發(fā)現(xiàn)在小劑量IR(3Gy)處理后,caffeine和wortmannin均能抑制這四個SQ位點的磷酸化;而當(dāng)用大劑量IR(10Gy)處理后,w

8、ortmannin能完全抑制這四個SQ位點的磷酸化,但caffeine的抑制效果不明顯.然后用ATM、ATR和DNA-PKcs特異性的siRNA分別敲除細(xì)胞中這些激酶,發(fā)現(xiàn):ATM被敲除后,在細(xì)胞用小劑量IR處理后這四個位點磷酸化水平明顯降低;當(dāng)DNA-PKcs被敲除后,在細(xì)胞用大劑量的IR處理后這四個位點磷酸化水平明顯降低,但對小劑量的IR處理沒有明顯效果.綜上所述,在小劑量IR處理后,ATM是這四個位點磷酸化的主要激酶;在大劑量IR

9、處理后,DNA-PK也參與了這四個位點的磷酸化. 在以下的所有實驗中均采用小劑量IR(3Gv)處理細(xì)胞. 2.DNA損傷誘導(dǎo).Artemis的磷酸化在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用研究 首先對上述已經(jīng)被鑒定的四個磷酸化位點在IR處理后的磷酸化動力學(xué)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)S534和S538兩個位點在IR處理后的30分鐘內(nèi)被快速磷酸化,在2小時后又被快速的去磷酸化;而S516和S6415兩個位點在IR處理后的30分鐘內(nèi)被磷酸化,且其

10、磷酸化一直維持在較高水平,直到24小時后才緩慢下降.本課題首先將上述四個位點的絲氨酸殘基(S)分別突變成丙氨酸(A)構(gòu)建四個位點的單突變體(S516A,S534A,S538A和S645A),并在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),經(jīng)IR處理后,然后進(jìn)行細(xì)胞周期的分析,結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)分別表達(dá)四個單突變體的細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生改變.由于S516和S645,S534和S538具有相似的磷酸化動力學(xué),本課題又分別構(gòu)建S516-645A和S534-538A

11、兩個雙突變體,并在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá),然后進(jìn)行細(xì)胞周期的分析.與表達(dá)野生型Artemis的HEK293細(xì)胞相比,表達(dá)S516-645A雙突變體的HEK293細(xì)胞在IR處理后12小時至24小時之間,G2/M期細(xì)胞明顯聚集.當(dāng)將這兩個絲氨酸殘基同時突變成天冬氨酸(S516-645D)來模擬這兩個位點的磷酸化時,其表型與野生型的完全相同. 3.Artemis蛋白S516和S645位點的磷酸化在G2/M eheekpoint r

12、ecovery中的作用的分子機(jī)制的研究Cdkl 的磷酸化狀態(tài)影響著Cdkl的活性,從而實施對細(xì)胞由G2向M期轉(zhuǎn)換的調(diào)控.利用Western blot對Cdk1的磷酸化狀態(tài)進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,在IR處理后,與表達(dá)野生型Artemis和表達(dá)S516-645D的HEK293細(xì)胞系相比,表達(dá)S516-645A的HEK293細(xì)胞系的Cdkl的第14位蘇氨酸和第15位酪氨酸(該兩個位點為抑制性磷酸化位點)的磷酸化水平較高且維持時間長,在IR處理后1

13、8小時,表達(dá)野生型Artemis和表達(dá)S516-645D的HEK293細(xì)胞系的Cdkl均已去磷酸化,而在表達(dá)S516-645A的HEK293細(xì)胞系中Cdkl仍然處于高抑制性磷酸化狀態(tài).這一結(jié)果不僅進(jìn)一步證實了前面研究得到的細(xì)胞周期的結(jié)果,同時表明DNA損傷后,Artemis是Cdkl的調(diào)節(jié)蛋白. 由于Cdkl的磷酸化是受Cdkl抑制性磷酸化激酶Mytl/Weel和活化性酪氨酸磷酸酶Cdc25C之間的動態(tài)平衡精確調(diào)節(jié)的.利用Wes

14、tern blot分析表達(dá)S516-645A的HEK293細(xì)胞系和表達(dá)野生型Artemis的HEK293細(xì)胞系中Weel和Cdc25C蛋白表達(dá)水平,結(jié)果顯示:Weel和Cdc25C蛋白表達(dá)水平在兩株細(xì)胞之間沒有差異,或有差異,但該差異與G2/M阻滯延長的預(yù)期方向相反.同時,Cdc25C在兩株細(xì)胞內(nèi)的分布也沒有差異. 結(jié)論: 1.當(dāng)細(xì)胞受到IR處理后,Artemis蛋白中的S516、S534、S538和S645四個位點發(fā)生

15、磷酸化. 2.當(dāng)細(xì)胞受到小劑量 IR 處理后,ATM是負(fù)責(zé)S516、S534、S538和S645四個位點磷酸化的主要激酶;當(dāng)細(xì)胞受到大劑量IR處理后,DNA-PK也參與了這四個位點的磷酸化. 3.IR 處理后,這四個位點的磷酸化動力學(xué)是不同的.S534和S538在短時間內(nèi)快速磷酸化,又在短時間內(nèi)被快速去磷酸化;S516和S645在短時間內(nèi)發(fā)生磷酸化,并在長時間內(nèi)維持較高的磷酸化水平.因此,S534和S538可能具有相同或

16、相似的功能,而S516和S645可能具有相同或相似的功能. 4.S516和S645的磷酸化參與了DNA損傷后的 G2/M checkpoint recovery,使得細(xì)胞在G2/M checkpoint被關(guān)閉后恢復(fù)正常的細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞由G2期向M期轉(zhuǎn)換. 5.DNA損傷后,Artemis是Cdk1磷酸化的調(diào)節(jié)蛋白. 6.Artemis通過影響cyclin B實施對Cdk1磷酸化的調(diào)控. 7.Artem