Caveolin-1磷酸化在內(nèi)毒素致小鼠急性肺損傷中的作用.pdf

1、目的：觀察和研究小凹蛋白-1(Caveolin-1)磷酸化在內(nèi)毒素致小鼠急性肺損傷中的作用及其潛在機(jī)制。
　　方法：體外實驗通過向穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TLR4-MD2-CD14的HEK-293細(xì)胞系和Caveolin-1(Cav-1)基因敲除小鼠的肺內(nèi)皮細(xì)胞(Cav-1-/-MLECs)內(nèi)轉(zhuǎn)染野生型Cav-1 cDNA(WT)和不能磷酸化的突變型Cav-1 cDNA(Y14F)，研究LPS誘發(fā)的Cav-1磷酸化對LPS-TLR4信號通路的影響

2、，并探索其機(jī)制。免疫印跡法檢驗Cav-1蛋白的表達(dá)以及Cav-1和Src激酶的磷酸化水平。檢測IκB-α蛋白的降解程度和NF-κB的激活程度。使用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基中IL-6和TNF-α的濃度。使用免疫共沉淀技術(shù)檢測Cav-1和TLR4，TLR4和MyD88的相互作用及其變化。
　　體內(nèi)實驗用野生型(Cav-1+/+)和Cav-1基因敲除(Cav-1-/-)小鼠，采用新鮮制備的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染法，將WT Cav-1和Y

3、14F Cav-1cDNA轉(zhuǎn)染到Cav-1皋因敲除小鼠體內(nèi)，使肺組織重新表達(dá)Cav-1蛋白(WT Cav-1或者Y14F Cav-1)。然后利用LPS致小鼠急性帥損傷模型，研究LPS誘導(dǎo)的Cav-1磷酸化在急性肺損傷形成過程中的作用。免疫印跡法檢測Cav-1和磷酸化Cav-1的蛋白表達(dá)。ELISA法檢測血漿中IL-6和TNF-α的濃度。測量腫的濕干重比，判斷腫水腫程度。另取Cav-1敲除小鼠36只，分為3組(n=12)：Control組

4、，WT組(WT)和Y14F組(Y14F)，分別轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒，WT Cav-1 cDNA和Y14F Cav-1 cDNA。轉(zhuǎn)染成功后，對小鼠腹腔注射致死劑量LPS(20mg/kg)，觀察96小時內(nèi)兩組小鼠存活率的差別。
　　結(jié)果：體外實驗證明，LPS刺激能夠引起Cav-1的快速的磷酸化，而且這種磷酸化是Src依賴性的。通過使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染TLR4-MD2-CD14的HEK-293細(xì)胞系和Cav-1敲除小鼠的肺內(nèi)皮細(xì)胞，我們有力的證明了L

5、PS所誘發(fā)的Car-1的磷酸化能夠增加Cav-1和TLR4之間的相互作用以及接下來的TLR4與MyD88之間的相互作用，從而最終導(dǎo)致了NF-κB的激活以及促炎癥因子的產(chǎn)生。
　　在體內(nèi)實驗中，通過使用基因技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染野生型的Cav-1 cDNA相比，往Cav-1基因敲除小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染入不能磷酸化的(Cav-1 cDNA(Y14F)更能抵抗LPS的侵襲。這證明Caveolin-1的磷酸化是內(nèi)毒素致急性肺損傷病理機(jī)制中重要的因素