骨橋蛋白在內(nèi)毒素致大鼠急性肺損傷后肺纖維化中的作用研究.pdf

1、目的:采用腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)建立大鼠急性肺損傷(actue lung injury,ALI)后肺纖維化模型,了解肺組織骨橋蛋白(osteopontin,OPN)表達(dá)水平以及OPN對脂多糖致大鼠急性肺損傷后肺纖維化肺組織中羥脯氨酸、轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)水平的影響,從而探討OPN在脂多糖致大鼠急性肺損傷后肺纖維化中所處的地位與作用。
　　 方法：①將

2、90只清潔級Wistar雄性健康大鼠,平均體重約150-180g,按隨機(jī)數(shù)字表將動物分為正常對照組(NS組,n=30)、模型組(ALI組,n=30)、干預(yù)組(n=30)。ALI組:于第0、1、2天腹腔注射LPS(5mg.kg-1.d-1,每1mgLPS溶于1ml的無菌生理鹽水中),在LPS注射5分鐘后腹腔注射生理鹽水(0.5ml)；干預(yù)組:第0、1和2天腹腔注射LPS(5mg.kg-1.d-1),LPS注射5分鐘后腹腔注射骨橋蛋白抗體(

3、Anti-OPN-Ab)(0.5ml.d-1),效價為1:32)；NS組:第0、1、2天腹腔注射生理鹽水(5ml.kg.d-1),第一次腹腔注射生理鹽水5分鐘后再次腹腔注射生理鹽水(0.5ml.d-1)；各組大鼠分別于4小時、8小時、24小時、7天、14天、28天隨機(jī)處死動物各5只留取標(biāo)本。②病理組織HE染色及Masson染色進(jìn)行肺損傷及肺纖維化的評分。③測定羥脯氨酸的含量,具體操作按照試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。④免疫組織化學(xué)測定肺組織

4、中TGF-β1的表達(dá)。⑤實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitatiVe reverse transcription-polymerase chainreaction,FQ RT-PCR)檢測肺組織Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA的表達(dá)。⑥免疫印跡法(Western blotting)檢測各組肺組織勻漿中OPN表達(dá)水平,用OPN／β-actin(光密度比值)表示。
　　 結(jié)果:①NS組大鼠肺組織小葉結(jié)構(gòu)正常,

5、肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰,肺間質(zhì)無炎性侵潤,無纖維結(jié)締組織增生,肺泡壁正常。ALT組8小時組可見肺泡壁增厚,肺泡腔內(nèi)及肺間質(zhì)可見大量炎性細(xì)胞及藍(lán)色膠原纖維增多,7天組可見正常肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡腔閉陷、融合,由藍(lán)色膠原纖維及炎性細(xì)胞占據(jù)形成纖維化,14天及28天炎癥較前減輕,肺纖維化程度加重；干預(yù)組上述病理表現(xiàn)較ALI組有明顯減輕。②ALI組大鼠肺組織羥脯氨酸含量、TGF-β1、Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)呈進(jìn)行性增加,同一時間點與NS組相差顯著(P

6、<0.05)；干預(yù)組隨時間增長表達(dá)也為進(jìn)行性增加,與NS組比較差異有顯著意義(P<0.05),但與ALI組比較有明顯下降(P<0.05)。④OPN在大鼠肺組織中的表達(dá):NS組檢測到OPN少量的表達(dá),而ALI組和干預(yù)組OPN的表達(dá)隨時間的增加而表達(dá)增多,28天表達(dá)最明顯；進(jìn)一步經(jīng)軟件灰度分析提示,同一時間點ALI組和干預(yù)組間OPN表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:①腹腔注射LPS能成功誘導(dǎo)ALI后肺纖維化動物模型,8小