內(nèi)源性CO在褪黑素減輕內(nèi)毒素休克致大鼠急性肺損傷中的作用.pdf

1、目的：急性肺損傷（Acute lung injury，ALI）是指由心源性以外的肺內(nèi)外各種致病因素導(dǎo)致的急性進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭。實質(zhì)是全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）和多器官功能障礙綜合征（MODS）在肺部的表現(xiàn)。其發(fā)病機(jī)理錯綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，亦無滿意的治療措施。近年來研究發(fā)現(xiàn)ALI是機(jī)體發(fā)生損傷和抗損傷動態(tài)發(fā)展的病理過程，肺部氧化/抗氧化以及促炎/抗炎反應(yīng)失衡在ALI的發(fā)病中起主要作用，在ALI發(fā)展過程中炎癥細(xì)胞因子可誘導(dǎo)i

2、NOS表達(dá)，持續(xù)產(chǎn)生超生理量的一氧化氮（nitricoxide，NO），NO與超氧陰離子反應(yīng)的產(chǎn)物過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite，ONOO-）過量生成，可引起組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷和功能代謝改變，其中NO在自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的發(fā)生及由此引起的氧化損傷中是一關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有文獻(xiàn)報道在NO升高的同時伴有肺間質(zhì)水腫、出血、炎癥細(xì)胞浸潤、肺泡結(jié)構(gòu)破壞，可見iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO參與肺損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　 當(dāng)肺臟局部產(chǎn)生劇烈的

3、氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時可激活體內(nèi)的抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境平衡，抵抗氧化應(yīng)激損傷。
　　 血紅素氧合酶-1（hemexoygnease-1，HO-1）是體內(nèi)抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的重要成員之一。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，HO-1在心血管、肺、肝、腎等重要器官中誘導(dǎo)表達(dá)，催化血紅素代謝生成膽紅素、鐵離子、一氧化碳（carbonmnoxo，CO）。HO-1/CO系統(tǒng)通過多方面調(diào)節(jié)效應(yīng)，產(chǎn)生抗氧化、抗凋亡、抗炎癥、抗增殖等一系列生物學(xué)效應(yīng)，因此HO

4、-1/CO系統(tǒng)在ALI時維持肺臟氧化/抗氧化的平衡具有重要的現(xiàn)實意義。
　　 褪黑素（melatonin，MT）是1958年Leme等首先從牛的松果腺分離純化得到的，MT是松果腺分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有廣泛的生物學(xué)作用，由于具有高度彌散穿透能力，故能通過核膜進(jìn)入核內(nèi)發(fā)揮作用，對生物的晝夜節(jié)律、性成熟及生殖、免疫反應(yīng)、腫瘤、衰老等均有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)MT具有很強(qiáng)的清除羥自由基和過氧自由基作用，不僅可直接清除OH·O2

5、-，還可通過增加抗氧化酶的活性而發(fā)揮其作用，是目前已知體內(nèi)最強(qiáng)的抗氧化成分。但MT減輕ALI時的氧化應(yīng)激損傷其機(jī)制是否與增加HO-1蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO有關(guān)，相關(guān)文獻(xiàn)報道很少。
　　 本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）復(fù)制大鼠ALI動物模型，旨在在體實驗觀察內(nèi)源性CO在褪黑素減輕內(nèi)毒素休克致大鼠急性肺損傷中的作用及MT、抗ALI機(jī)制，為MT的臨床應(yīng)用提供一定的理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：實驗通過CLP

6、復(fù)制ALI模型，80只雄性wistar大鼠，體重225±25g，隨機(jī)分為八組，每組10只。①假手術(shù)對照組（Sham組）：盲腸根部穿過絲線，不行結(jié)扎和穿孔；②CLP組：復(fù)制CLP模型；③MT組：腹腔注射（ip）MT10mg/kg（MT先被無水乙醇溶解，再用生理鹽水稀釋，使乙醇的終濃度為1％）；④MT+CLP組：復(fù)制模型前、后30min各ip MT（10mg/kg）；⑤CLP+ZnPP（HO-1抑制劑）組：手術(shù)前20min舌下靜脈注入Znp

7、p（10mg/Kg，10mg/ml）；⑥MT+CLP+ZnPP組：手術(shù)前、后30min各ip MT（10mg/kg）其后10min舌下靜脈注入ZnPP；⑦CLP+Hemin（CO供體）組：手術(shù)前20min舌下靜脈注入Hemin（10mg/Kg，10mg/ml）；⑧MT+CLP+Hemin組：手術(shù)前、后30min各ip MT（10mg/kg）其后10min舌下靜脈注入Hemin。以上各組在手術(shù)后6小時觀察動物的行為學(xué)表現(xiàn)，觀察完畢后立即麻

8、醉，于實驗結(jié)束前30分鐘，從動物的右側(cè)頸靜脈插管至右心房，分離左頸動脈插管至主動脈根部，采集血液分別代表/肺血（In-flowing pulmonary blood，IPB）和出肺血（Out-goingpulmonary blood，OPB），檢測血液中碳氧血紅蛋白（carboxyhemoglobin，COHb）水平代表CO含量；開胸取材，取部分右肺下葉，標(biāo)本共分為兩部分：一部分制備勻漿檢測SOD、MDA、MPO、GSH的活性和含量變化

9、；另一部分觀察形態(tài)學(xué)變化，同時采用免疫組織化學(xué)染色和圖像分析觀察肺組織中HO-1以及iNOS的表達(dá)和分布
　　 數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來表示，組間差異用單因素方差分析（one wayANOVA），有顯著差異者用SNK-q檢驗進(jìn)行兩兩比較，均以P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.動物的行為學(xué)表現(xiàn)：CLP組大鼠呼吸急促、精神萎靡、蜷縮成團(tuán)、毛發(fā)豎起、未見攝食。
　　 2.肺組織形態(tài)學(xué)

10、觀察：假手術(shù)對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁薄，而CLP組大鼠部分肺泡萎陷，部分肺泡出現(xiàn)代償性肺氣腫，肺內(nèi)小血管擴(kuò)張充血，肺泡間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤伴出血，與CLP組相比，Hemin+CLP組、MT+Hemin+CLP組和MT+CLP組病理損傷程度輕，其中MT+Hemin+CLP組損傷最輕；而ZnPP+CLP組與MT+ZnPP+CLP組病理損傷程度重，其中ZnPP+CLP組損傷較重。與MT+CLP組相比，MT+Hemin+CLP組病理

11、損傷程度輕，MT+ZnPP+CLP組病理損傷程度重。
　　 3.肺組織中MDA含量、MPO活性、SOD活性、GSH含量的變化：與假手術(shù)對照組相比，CLP組肺組織中MDA含量、MPO活性增高，SOD活性、GSH含量降低；與CLP組相比，MT+CLP組、MT+CLP+Hemin組和Hemin+CLP組肺組織中MDA含量、MPO活性明顯降低，SOD活性、GSH含量增高，其中MT+CLP+Hemin變化最明顯（P均<0.05）；而ZnP

12、P+CLP組和MT+ZnPP+CLP組肺組織MDA含量、MPO活性增高，SOD活性、GSH含量降低，其中ZnPP+CLP組變化最顯著（P均<0.05）；和MT+CLP組相比，MT+CLP+Hemin組肺組織中MDA含量、MPO活性降低，SOD活性、GSH含量增高（P均<0.05）；而MT+ZnPP+CLP組肺組織MDA含量、MPO活性增高，SOD活性、GSH含量降低（P均<0.05）。
　　 4.COHb水平：各組OPB中COH

13、b水平均顯著高于IPB的COHb水平。CLP和MT組的IPB和OPB中的COHb水平以及肺組織中CO含量較假手術(shù)對照組增高，OPB與IPB中的COHb水平之差（OPB-IPB）增大（P均<0.05），與CLP組相比，MT+CLP組、MT+CLP+Hemin組和Hemin+CLP組IPB和OPB中的COHb水平以及肺組織中CO含量增高，OPB與IPB中的COHb水平差值（OPB-IPB）增大（P均<0.05），其中MT+CLP+Hemin

14、組升高最明顯，而ZnPP+CLP組和MT+ZnPP+CLP組IPB和OPB中的COHb水平以及肺組織中CO含量降低（P均<0.05），其中MT+ZnPP+CLP組與ZnPP+CLP組與假手術(shù)對照組相比無顯著差異；而與MT+CLP組相比MT+CLP+Hemin組中IPB和OPB中的COHb水平以及肺組織中CO含量增高（P均<0.05），而MT+ZnPP+CLP組IPB和OPB中的COHb水平以及肺組織中CO含量降低（P均<0.05）。

15、r>　　 5.肺組織免疫組織化學(xué)染色觀察：（1）假手術(shù)對照組僅有少量HO-1蛋白表達(dá)的陽性信號，CLP組和MT組中肺組織出現(xiàn)較多HO-1蛋白表達(dá)的陽性信號，主要分布在肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管粘膜及肺泡上皮細(xì)胞和肺血管平滑肌細(xì)胞等的胞漿內(nèi)； MT+CLP組、MT+CLP+Hemin組和Hemin+CLP組均可使HO-1蛋白表達(dá)增多，其中MT+CLP+Hemin組增高最顯著，而CLP+ZnPP組和MT+CLP+ZnPP組中HO-1陽性表達(dá)則有

16、所下降，其中MT+CLP+ZnPP組與CLP+ZnPP組與假手術(shù)對照組相比無明顯變化；與MT+CLP組相比，MT+CLP+ZnPP組HO-1的表達(dá)降低，而MT+CLP+Hemin組中HO-1的表達(dá)升高。（2）iNOS：CLP組iNOS蛋白表達(dá)較假手術(shù)對照組組增強(qiáng)；而與CLP組相比，MT+CLP組、MT+CLP+Hemin組和Hemin+CLP組肺組織中iNOS表達(dá)降低，而CLP+ZnPP組與MT+ZnPP+CLP組中iNOS表達(dá)則增高；

17、與MT+CLP組相比，MT+CLP+Hemin組肺組織中iNOS表達(dá)降低，而MT+ZnPP+CLP組iNOS表達(dá)增高。
　　 結(jié)論：
　　 1 CLP可引起大鼠肺組織嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，說明成功地復(fù)制了ALI動物模型。
　　 2 CLP可以導(dǎo)致ALI，肺組織中HO-1蛋白表達(dá)增多，同時出入肺血中COHb水平增高，MT可使肺組織中HO-1蛋白表達(dá)進(jìn)一步增多，肺損傷減輕。
　　 3 MT對ALI時的肺臟起明顯的保