多環(huán)芳香烴受體介導的非小細胞肺癌EGFR TKIs耐藥機制研究.pdf

1、肺癌是世界上致死率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌病例85％以上，是最常見的肺癌類型，研究NSCLC發(fā)生發(fā)展的機理一直是本領域的重點和難點。隨著分子生物學研究手段的進步，人們已經(jīng)意識到NSCLC不再是一種疾病，而是一類由特定基因驅(qū)動的異質(zhì)性疾病，過去一塵不變的治療模式已經(jīng)不能適應個體化治療的需求，以表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）和ROS1激酶為代表的靶向治療引領NSCLC精準醫(yī)療時代的到來，

2、吉非替尼、厄洛替尼和克唑替尼等一系列酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）顯著改善了NSCLC患者預后，極大的提高了患者生活質(zhì)量，是過去十年腫瘤臨床治療和基礎研究的重大突破。不幸的是幾乎所有患者在接受TKIs治療一段時間后耐藥復發(fā)，嚴重影響了TKIs的長期療效和臨床應用，因此闡明TKIs耐藥的分子機制、制定克服耐藥的治療策略、盡最大可能推遲耐藥現(xiàn)象出現(xiàn)是臨床醫(yī)生和科學家共同面臨的難題和挑戰(zhàn)。TKIs耐藥原因尚未完全解析，以EGFR TKIs獲得性

3、耐藥為例，仍有約20%患者耐藥機制不清，這部分患者也沒有切實有效的耐藥后治療方案。
　　多環(huán)芳香烴受體（AhR）是一個受配體活化的胞內(nèi)受體，在過去的近40年里人們一直認為AhR信號通路活化后轉(zhuǎn)錄激活下游代謝酶，其全部功能由轉(zhuǎn)錄因子活性介導；近些年研究發(fā)現(xiàn)AhR還有一些生物學功能不依賴其轉(zhuǎn)錄活性，且AhR調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、周期轉(zhuǎn)化等新功能與代謝酶表達無關。AhR在多種實體瘤組織和細胞系中過度表達，回顧性研究提示AhR表達水平

4、與腫瘤惡性程度正相關。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AhR蛋白在TKIs耐藥的患者標本中表達亦增加，但其意義并不清楚。
　　本文揭示了AhR蛋白負向調(diào)控NSCLC TKIs敏感性的作用，提出活化的AhR作為銜接蛋白（adaptor protein）招募Src和Jak2兩種激酶，形成的Jak2-AhR-Src復合物可以繞過EGFR旁路活化下游PI3K/Akt和MEK/Erk信號通路導致TKIs耐藥；在高表達內(nèi)源性AhR蛋白的耐藥細胞用藥物或sh

5、RNA抑制AhR可以逆轉(zhuǎn)TKIs耐藥性，而在敏感細胞過表達AhR則導致TKIs耐藥性；此外，AhR與Src和Jak2蛋白相互作用不依賴其轉(zhuǎn)錄因子活性，活化的AhR瞬時轉(zhuǎn)位到近膜側(cè)，攜帶胞漿內(nèi)Src蛋白與Jak2結(jié)合，促使Jak2磷酸化Src，Jak2 TKIs和Src TKIs可以阻斷AhR蛋白介導的激酶旁路。本研究發(fā)現(xiàn)AhR蛋白招募激酶的新功能，闡明了TKIs耐藥患者AhR表達增加的意義及其導致耐藥的分子機制，為克服EGFR TKIs

6、耐藥提供新的思路。
　　方法：
　?。?） TCGA數(shù)據(jù)庫和組織芯片分析AhR在mRNA和蛋白水平與NSCLC惡性程度、淋巴結(jié)侵犯和患者預后的相關性。
　?。?）構(gòu)建野生型AhR（AhR WT）和組成型活化AhR（AhR CA）表達載體和shRNA，包裝慢病毒感染細胞，MTT、平板克隆、Western blot、IHC、TUNEL染色等實驗研究上調(diào)和下調(diào)AhR對EGFR TKIs敏感性的影響。
　?。?）構(gòu)建入核

7、信號缺失的AhRΔNLS突變體，shRNA下調(diào)ARNT、cyp1a1和cyp1b1表達，檢測AhR轉(zhuǎn)錄活性對EGFR TKIs敏感性的影響。
　　（4）慢病毒感染細胞過表達Src或shRNA下調(diào)Src，使用Src TKIs抑制其激酶活性，MTT、Western blot、IHC等實驗研究Src在AhR信號通路活化導致EGFR TKIs耐藥中的作用。
　　（5）蛋白激酶芯片篩選引起Src磷酸化的激酶，HEK293細胞轉(zhuǎn)染Jak

8、2、Src和AhR質(zhì)粒，IP和Western blot實驗研究AhR和Jak2/Src激酶的相互作用。
　　結(jié)果：
　?。?） AhR在mRNA水平與NSCLC級別和預后無明顯相關性，相反，AhR在蛋白水平表達越高，腫瘤侵襲性越強，患者預后越差。Western blot結(jié)果顯示TKIs耐藥細胞AhR蛋白表達亦增加。
　　（2） AhR抑制劑α-NF或shRNA下調(diào)AhR，細胞學水平表達增敏EGFR TKIs，阻斷下游P

9、I3K/Akt和MEK/Erk信號通路，在裸鼠體內(nèi)明顯抑制瘤體體積，誘導細胞凋亡。
　　（3）慢病毒過表達AhR WT或配體活化AhR信號通路導致敏感細胞EGFR TKIs耐藥，Western blot顯示細胞Akt和Erk磷酸化水平增加且不能被EGFR TKIs抑制，然而過表達AhR CA則不能誘導耐藥，不增加Akt和Erk磷酸化水平。
　　（4）突變AhR入核信號NLS，shRNA下調(diào)ARNT，cyp1a1和cyp1b1

10、，去除AhR轉(zhuǎn)錄因子活性并不影響AhR上述效應，說明AhR引起耐藥的作用與其靶基因轉(zhuǎn)錄無關。
　　（5）生物信息學預測和體內(nèi)外功能學實驗顯示Src激酶活化是AhR導致耐藥的關鍵事件，AhR通過其SH2結(jié)合模體招募Src并促進Y416位點磷酸化，旁路活化下游PI3K/Akt和MEK/Erk信號通路。Src TKIs或Src shRNA聯(lián)合EGFR TKIs可以阻斷持續(xù)性活化的PI3K/Akt和MEK/Erk信號通路，體外抑制細胞增殖

11、，體內(nèi)減少Ki67陽性細胞比例，克服EGFR TKIs耐藥。
　?。?）蛋白激酶芯片結(jié)果強烈提示Jak2磷酸化下游激酶的作用，IP實驗顯示活化AhR信號通路促進AhR蛋白瞬時轉(zhuǎn)位到細胞近膜側(cè)，招募Jak2和Src兩個激酶，使下游PI3K/Akt和MEK/Erk通路活化，Jak2 TKIs和Jak2 shRNA抑制Src磷酸化，克服AhR活化導致的EGFR TKIs耐藥。
　　結(jié)論：總結(jié)整個課題，發(fā)現(xiàn)一個新的EGFR TKIs