HuR通過調(diào)節(jié)Bim表達(dá)參與非小細(xì)胞肺癌EGFR--TKI原發(fā)性耐藥的機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　肺癌是致死率高的惡性腫瘤之一。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)大約占肺癌類型的80％。2004年，人們發(fā)現(xiàn)在NSCLC中存在表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的突變，且大多數(shù)突變陽性的患者對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)如吉非替尼及厄洛替尼等敏感。接受EGFR-TKI治療的EGFR突變陽性的NSCLC患者中位生存期較化療明顯提高。然而，即使存在EGFR敏感突變，其中仍有20-30％的患者對EG

2、FR-TKI原發(fā)性耐藥，且治療有效的患者不可避免的會產(chǎn)生獲得性耐藥。目前，有關(guān)EGFR-TKI獲得性耐藥的機(jī)制研究較多，如EGFR看守基因的二次突變(T790M)（約占50％）、MET擴(kuò)增（約20-25％）、肝細(xì)胞生長因子(HGF)高表達(dá)及向小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)化等。但有關(guān)原發(fā)性耐藥機(jī)制研究相對滯后。
　　Bim基因是Bcl-2家族促凋亡成員之一。有研究發(fā)現(xiàn)，Bim基因的表達(dá)狀態(tài)可能與EGFR突變陽性患者對EGFR-TKI的療效存在相關(guān)性

3、，但Bim基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制不明。人抗原R(HuR)是胚胎致死視覺異常(ELAV)家族的RNA結(jié)合蛋白，它可調(diào)節(jié)多種分子mRNA的穩(wěn)定性，如cyclin A、cyclin B、TNF-α、IL-6和IL-8等。HuR都是通過與靶基因的3'UTR端ARE元件結(jié)合，調(diào)控靶基因mRNA穩(wěn)定性及蛋白的表達(dá)。我們分析Bim基因的mRNA序列后發(fā)現(xiàn)，其3'UTR端含有多個AU元件，具備與RNA結(jié)合蛋白相互作用的分子基礎(chǔ)。因此，我們推測作為RNA結(jié)合

4、蛋白之一的HuR可能會調(diào)控Bim表達(dá)。
　　目的：
　　研究HuR與Bim在NSCLC中的表達(dá)與EGFR-TKI藥物敏感性的關(guān)系，對HuR通過調(diào)控Bim表達(dá)影響EGFR突變陽性的肺腺癌細(xì)胞株對EGFR-TKI原發(fā)耐藥進(jìn)行深入的研究，以期為臨床判斷EGFR-TKI藥物治療效果及克服耐藥提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、免疫組織化學(xué)法檢測HuR和Bim蛋白在EGFR突變陽性NSCLC組織中的表達(dá)（54例臨床評價敏感

5、和27例臨床評價原發(fā)耐藥），并分析腫瘤HuR與Bim表達(dá)、臨床病理特征間的關(guān)系，進(jìn)一步亞組分析EGFR-TKI敏感患者中HuR、Bim表達(dá)與PFS之間的關(guān)系。
　　2、以H1650、HCC827及PC-9肺癌細(xì)胞為主要體外模型，給予吉非替尼藥物處理后，用CCK-8法檢測三種細(xì)胞的增殖情況。
　　3、應(yīng)用Western blotting、定量RT-PCR方法檢測三種細(xì)胞HuR、Bim mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　4、

6、在HCC827細(xì)胞中用siRNA干擾HuR表達(dá)，用吉非替尼藥物處理后，用CCK-8、AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測干擾組與對照組細(xì)胞增殖和凋亡情況，并計(jì)算其IC50值。
　　5、Western blotting和定量RT-PCR分別檢測HCC827細(xì)胞干擾組及對照未干擾組HuR及Bim在mRNA和蛋白水平變化，以明確干擾HuR對Bim的影響。
　　6、構(gòu)建過表達(dá)HuR的慢病毒載體，包裝病毒，隨后感染H1650細(xì)胞;用CC

7、K-8、AnnexinⅤ/PI雙染色法檢測感染組與對照組細(xì)胞增殖和凋亡情況，并計(jì)算其IC50值。
　　7、Western blotting和定量RT-PCR分別檢測H1650細(xì)胞感染組及對照組HuR及Bim在mRNA和蛋白水平變化，體外分析高HuR水平對H1650細(xì)胞Bim表達(dá)的影響。
　　8、用Balb/c小鼠，建立高表達(dá)HuR的H1650細(xì)胞皮下移植瘤模型，并觀察吉非替尼藥物處理后移植瘤生長情況，分析高HuR水平對EGF

8、R-TKI藥物敏感性的影響。
　　9、RT-PCR及Western blotting檢測移植瘤HuR、Bim mRNA和蛋白表達(dá)情況。
　　10、免疫組化染色檢測H1650移植瘤、對照組移植瘤中HuR及Bim表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、臨床評價敏感組及原發(fā)耐藥組NSCLC患者在性別方面存在顯著差別(p=0.01)，耐藥組女性患者占18.5％，敏感組女性患者占57.4％。敏感組及耐藥組在年齡、PS評分、突變類型

9、、pTNM分期、是否有既往手術(shù)史、化療史及是否存在腦轉(zhuǎn)移等方面未見明顯差別。
　　2、在原發(fā)耐藥組患者中，胞漿HuR陰性表達(dá)占81.5％;在敏感組患者中，陰性表達(dá)占20.4％;兩組間表達(dá)率存在顯著差異(p＜0.001)，耐藥組患者HuR陰性表達(dá)率顯著高于敏感組患者。同樣，在原發(fā)性耐藥的NSCLC患者中，Bim陰性表達(dá)占70.4％;在敏感組患者，陰性表達(dá)占7.4％;兩組間表達(dá)率存在差異(p＜0.001)，耐藥組患者Bim陰性表達(dá)率顯

10、著高于敏感組患者。
　　3、在耐藥組的患者中，胞漿HuR陰性表達(dá)與Bim陰性表達(dá)呈正相關(guān)(p＜0.01);Bim表達(dá)與患者年齡、性別及突變類型不相關(guān)。
　　4、在敏感組患者中，Bim陽性表達(dá)患者PFS為12.8個月，陰性表達(dá)組PFS為9.7月。Kaplan-Meier生存曲線顯示，Bim陽性組PFS顯著高于陰性組(p＜0.01)。
　　5、在敏感組患者中，HuR陽性表達(dá)患者PFS為16.5個月，陰性表達(dá)組PFS為9.7

11、月。Kaplan-Meier生存曲線顯示，HuR陽性組中位PFS顯著高于陰性組。
　　6、PC-9、HCC827及H1650細(xì)胞株對吉非替尼藥物的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):三種細(xì)胞的IC50值分別為0.05μml/L、0.004μml/L及21.28μml/L，三者比較前兩種細(xì)胞對吉非替尼高度敏感，H1650細(xì)胞則對吉非替尼表現(xiàn)為耐藥(p＜0.01)。
　　7、RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在三種肺癌細(xì)胞株中，HuR及Bim表達(dá)量存在差異

12、，其中在H1650細(xì)胞株中HuR、BimmRNA表達(dá)顯著低于另外兩株細(xì)胞(p＜0.01);Western blotting結(jié)果顯示，在H1650細(xì)胞株中HuR及Bim蛋白表達(dá)顯著低于另外兩株細(xì)胞株。
　　8、我們利用小于擾RNA對高表達(dá)HuR的HCC827細(xì)胞進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后行吉非替尼藥物毒性試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCC827未干擾組其IC50值為0.004μM，干擾組為8.142μM，干擾組細(xì)胞表現(xiàn)出對吉非替尼耐藥。兩組細(xì)胞給予吉非

13、替尼藥物處理后行細(xì)胞凋亡檢測發(fā)現(xiàn)，HCC827細(xì)胞干擾組調(diào)亡率較對照未干擾組降低(p＜0.05)。
　　9、RT-PCR檢測結(jié)果提示HCC827干擾組細(xì)胞HuR mRNA表達(dá)量低于未干擾組(p＜0.01);Western blotting結(jié)果顯示干擾組HuR蛋白表達(dá)顯著低于未干擾組。我們對HCC827細(xì)胞Bim mRNA及蛋白進(jìn)行檢測，RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾組Bim mRNA表達(dá)明顯低于未干擾組(p＜0.01)，Western

14、blotting結(jié)果顯示蛋白表達(dá)干擾組低于未干擾組。
　　10、我們構(gòu)建了過表達(dá)HuR慢病毒表達(dá)載體(GV365-HuR)，轉(zhuǎn)染H1650細(xì)胞后獲得穩(wěn)定過表達(dá)HuR的H1650細(xì)胞株。
　　11、過表達(dá)HuR的H1650細(xì)胞株及對照組細(xì)胞分別給予吉非替尼處理，CCK-8法測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)IC50值分別為0.875μM、21.28μM(p＜0.01)，提示過表達(dá)HuR增加了NSCLC細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。細(xì)胞凋亡結(jié)果提示，過表達(dá)

15、HuR的H1650細(xì)胞凋亡率較對照組顯著升高(p＜0.01)。
　　12、RT-PCR結(jié)果提示，過表達(dá)HuR的H1650細(xì)胞HuR及Bim mRNA表達(dá)量顯著高于對照組(p＜0.01);Western Blotting結(jié)果顯示HuR及Bim蛋白表達(dá)水平也顯著高于對照組。
　　13、動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)HuR的移植瘤經(jīng)吉非替尼處理后，與對照組比較腫瘤生長明顯受到抑制。處死小鼠后發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)HuR的移植瘤體積及重量顯著低于對