凋亡細胞對巨噬細胞IL-12家族細胞因子調控的研究.pdf

1、目的:機體通過吞噬作用清除凋亡細胞(apoptotic cell，apo)，避免凋亡細胞的具有潛在細胞毒性、免疫原性或致炎性的壞死成分暴露在周圍環(huán)境中引發(fā)自身免疫反應和炎癥反應，這是機體一種重要的防御功能。因此快速有效清除體內的凋亡細胞對人體正常生長發(fā)育和維持內環(huán)境穩(wěn)定起著至關重要的作用，凋亡細胞主要由專職吞噬細胞如巨噬細胞、未成熟的樹突狀細胞等吞噬清除，部分被非專職吞噬細胞如成纖維細胞、上皮細胞等吞噬。機體控制炎癥不單單是通過快速有效

2、的清除凋亡細胞，還包括調控炎癥性細胞因子產生。近年來又有很多實驗證明細胞因子表達水平的變化與很多疾病相關，比如，白細胞介素-23(IL-23)高表達與類風濕性關節(jié)炎(RA)、銀屑病等自身免疫病和腫瘤等疾病相關，IL-12又對黑色素瘤、腸腺癌、肝癌[7]等腫瘤有抑癌作用。還有大量實驗發(fā)現凋亡細胞被巨噬細胞等抗原提呈細胞吞噬過程中會調控其細胞因子表達水平，比如正向調節(jié)IL-10和負向調節(jié)IL-12等。
　　IL-12家族中IL-12和

3、IL-23不僅結構上都是由兩個亞基(IL-12p35、IL-12p40和IL-23p19、IL-23p40)組成的異源二聚體結構，有共同的亞基p40，而且它們都可由激活的抗原提呈細胞產生。對于IL-12和IL-23與疾病的相關性已經有很多實驗報道，對于其作用機制也有了很多了解，本實驗由此著手，研究凋亡細胞對巨噬細胞受刺激表達IL-12家族細胞因子的調控方向和調控機制，重點研究IL-23細胞因子，為明確相關疾病的發(fā)生發(fā)展和細胞因子臨床應用

4、奠定分子學基礎。
　　方法:
　　1 Jurkat細胞（人外周白血病T細胞）的復蘇、培養(yǎng)及凋亡細胞的制備，流式細胞技術檢測細胞凋亡情況。
　　2小鼠腹腔巨噬細胞的提取、培養(yǎng)。
　　3 RAW264.7細胞和小鼠腹腔巨噬細胞分別用空白、凋亡細胞(apotosis cell)、脂多糖(LPS)和凋亡細胞+LPS刺激。實時定量PCR(Real-time PCR)檢測各組mIL-12p35、mIL-12p40、mIL-2

5、3p19水平。
　　4、用ELISA方法檢測各組活化RAW細胞培養(yǎng)液IL-10、前列腺素2(PGE2)和轉化生長因子-β(TGF-β)的量。
　　5、針對IL-23p19 RNA設計隨機引物，對各組刺激后RAW細胞做Real-time PCR檢測IL-23p19轉錄前水平。
　　6、用含IL-23p19基因啟動子的質粒轉染RAW細胞，培養(yǎng)48小時后裂解檢測各組熒光素蛋白強度。
　　7、對RAW細胞分別用凋亡細胞、

6、凋亡細胞+LPS刺激，刺激后加入轉錄抑制劑dichlorobenzimidazole(DRB)+放線菌素D(ACD)，阻止新的RNA產生，檢測兩組各時間點p19mRNA衰變情況。
　　8用Western Blot（免疫印跡實驗）檢測被刺激RAW細胞中總p38和磷酸化p38的含量。
　　9、用不同濃度的MAPK p38信號轉導通路阻斷劑SB203580作用RAW細胞后用LPS刺激，Real-time PCR檢測各組p19mRN

7、A水平。
　　10、設計質粒轉染RAW264.7細胞使其高表達p38，再分別用空白、apo、LPS刺激細胞，通過Real-time PCR檢測各組p19mRNA水平。
　　11、將apo+LPS刺激后的RAW細胞分兩組，其中一組加入SB203580，Real-time PCR檢測各時間點兩組p19mRNA水平。
　　結果:
　　1、用星形孢菌素(staurosporine)處理Jurket細胞成功制備凋亡細胞，提

8、供后續(xù)研究的刺激條件。
　　2、凋亡細胞(apo)+LPS作用于腹腔巨噬細胞產生的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA量較單獨用LPS刺激減低。凋亡細胞(apo)+LPS作用于RAW巨噬細胞產生的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA量較單獨用LPS刺激減低。差異具有統(tǒng)計學意義。所以凋亡細胞對LPS誘導巨噬細胞表達的IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA均有抑制作

9、用。
　　3、用ELISA方法檢測各組活化后RAW264.7細胞株和小鼠腹腔巨噬細胞分泌IL-10、PGE2、TGF-β的量，發(fā)現凋亡細胞對IL-10、PGE2的分泌無影響，但是促進TGF-β的分泌，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4、利用real-time PCR檢測分別用空白對照、凋亡細胞(apo)、LPS和凋亡細胞（apo）+LPS刺激的RAW細胞的mIL-23p19水平，發(fā)現凋亡細胞并沒有在轉錄水平上抑制IL-23p19的

10、表達，所以凋亡細胞對 mIL-23p19的抑制作用不是在轉錄水平實現的。
　　5、用含有mIL-23p19啟動子的質粒轉染RAW細胞后，培養(yǎng)裂解細胞檢測熒光素蛋白含量，發(fā)現凋亡細胞(apo)+LPS刺激的RAW細胞的熒光素蛋白最高，說明凋亡細胞不會抑制IL-23p19的啟動子的作用，進一步驗證凋亡細胞對mIL-23p19的抑制作用不是在轉錄水平實現的。
　　6、激活的RAW細胞加入轉錄抑制劑放線菌素D和dichloroben

11、zimidazole(DRB)檢測IL-23p19mRNA剩余量，發(fā)現單單LPS刺激RAW細胞產生IL-23p19mRNA的衰變速度慢于凋亡細胞(apo)+LPS共同刺激時。說明凋亡細胞抑制IL-23p19表達可能是通過促進IL-23p19mRNA衰變實現的，凋亡細胞的抑制作用是在轉錄后水平實現的。
　　7、通過Western Blot發(fā)現凋亡細胞（apo）+LPS刺激后的RAW細胞的磷酸化的p38含量明顯少于LPS刺激后的RAW

12、細胞，說明凋亡細胞抑制了p38的磷酸化，進而抑制了MAPK p38信號傳導通路。
　　8、RAW細胞加入不同濃度的MAPK p38信號轉導通路阻斷劑SB203580，再用LPS刺激，發(fā)現IL-23p19mRNA水平與SB203580濃度呈反比，說明MAPKp38信號轉導通路對巨噬細胞表達IL-23p19很重要。
　　9、與轉染空白質粒的RAW細胞相比，轉染后高表達p38的RAW細胞在被LPS刺激后IL-23p19mRNA水平

13、明顯增高，進一步說明MAPKp38信號轉導通路對巨噬細胞表達IL-23p19很重要。
　　10、用apo+LPS活化的RAW細胞加入SB203580組較未加組的p19mRNA衰變的快。
　　結論
　　1、凋亡細胞抑制活化巨噬細胞IL-12p35、IL-12p40、IL-23p19mRNA的表達。
　　2、凋亡細胞對IL-10和PGE2分泌無影響，但促進TGF-β的分泌。
　　3、凋亡細胞對mIL-23p19