慢性免疫性血小板減少性紫癜中IL-27的表達(dá)與作用及大劑量地塞米松治療對IL-12家族細(xì)胞因子的影響.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)性免疫性血小板減少性紫癜(primary immune thrombocytopenia, ITP)是一組免疫介導(dǎo)的血小板過度破壞所致的出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30℅。該病的臨床特點是以皮膚黏膜及內(nèi)臟出血、外周血血小板減少、骨髓巨核細(xì)胞發(fā)育成熟障礙為主要表現(xiàn)。自身抗體介導(dǎo)的血小板破壞增加是ITP的主要發(fā)病原因，即血小板膜表面糖蛋白(glycoprotein，GP)Ⅱb/Ⅲa和GPIb/IX復(fù)合物作為自身

2、抗原，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生自身抗體，這些特異性的自身抗體通過Fab段與血小板膜表面自身抗原結(jié)合。這些結(jié)合自身抗體的血小板最終被機(jī)體的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所清除，從而導(dǎo)致外周血血小板減少。
　　但是ITP發(fā)病具有明顯的異質(zhì)性。通過抗體檢測發(fā)現(xiàn)：只能在50-70℅的ITP患者體內(nèi)檢測到血小板自身抗體，且陰性結(jié)果不能排除診斷。ITP發(fā)病情況不能僅僅用體液免疫異常來解釋。因此，近年來ITP發(fā)病機(jī)制的研究已經(jīng)擴(kuò)展到細(xì)胞免疫方面。研究認(rèn)為，ITP

3、發(fā)病呈輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)l優(yōu)勢反應(yīng)，Thl優(yōu)勢反應(yīng)除可激活B細(xì)胞產(chǎn)生血小板自身抗體外，還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫異常在ITP發(fā)病及病情加重過程中起重要作用，其中Th1/Th2細(xì)胞亞群之間的平衡失調(diào)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)和Th17細(xì)胞數(shù)量增加、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞的數(shù)量減少和功能異常是ITP

4、細(xì)胞免疫應(yīng)答異常的關(guān)鍵因素。
　　白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-27是新近發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員之一，在調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化方面發(fā)揮了重要作用。早期的研究證實，IL-27通過激活STAT-1和STAT-3信號通路，誘導(dǎo)Th1細(xì)胞發(fā)育過程中T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(T-box expressed in T cells，T-bet)表達(dá)，伴隨產(chǎn)生大量的干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)，并抑制IL-4，

5、IL-5和IL-13等Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。但隨后的研究表明IL-27可以通過誘導(dǎo)STAT1和SOCS1信號通路下調(diào)Th17細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子孤核受體(Orphan nuclear
　　receptor，RORγt)來抑制IL-17的表達(dá)。因此，IL-27作為一種多效性免疫調(diào)節(jié)因子在免疫應(yīng)答過程中起雙重調(diào)控作用。
　　ITP是一種Th1和Th17細(xì)胞占優(yōu)勢的自身免疫性疾病。但目前有關(guān)IL-27在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用還不清楚，

6、且研究結(jié)論存在爭議。我們推測IL-27可能通過調(diào)節(jié)ITP患者Th細(xì)胞的分化從而參與ITP的發(fā)病。本課題將結(jié)合IL-27血漿水平和信使核糖核酸(messenger RNA，mRNA)表達(dá)，分析ITP患者的IL-27與Th細(xì)胞亞群及其分泌的細(xì)胞因子、實驗室指標(biāo)之間的關(guān)系，以探討IL-27在ITP發(fā)病機(jī)制中的作用，為ITP的病因研究和臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。
　　目的：
　　研究在慢性ITP患者中IL-27的表達(dá)情況，并探討其在慢性

7、ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：
　　1、慢性ITP患者31例，對照組來自于36例健康志愿者。
　　2、流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測Th1，Th2和Th17細(xì)胞百分比。
　　3、FlowCytomix技術(shù)檢測血漿中IL-27，IFN-γ，IL-4和IL-17A的水平。
　　4、實時熒光定量PCR法檢測IL-27，T-bet，GATA結(jié)合蛋白(GATA binging prote

8、in，GATA)3和RORγt mRNA表達(dá)。
　　5、提取慢性ITP患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells， PBMCs)加入外源性重組人IL-27培養(yǎng)2天，檢測培養(yǎng)后的PBMCs中Th1，Th2和Th17細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果：
　　1、慢性ITP患者血漿中IL-27，IFN-γ，IL-4和IL-17A細(xì)胞因子的水平：
　　與正常對照組相比，

9、IL-27，IFN-γ和IL-17A在慢性ITP患者外周血中顯著升高(IL-27：60.42±43.68 vs32.91±20.37 pg/ml，P=0.001；IFN-γ：40.12±19.14 vs23.21±10.87 pg/ml，P<0.001；IL-17A：29.6±28.08 vs9.21±7.9 pg/ml，P<0.001)。而IL-4在慢性ITP患者外周血中顯著降低(IL-4：57.69±17.71 vs78.7±29.

10、82pg/ml, P=0.001)。
　　2、慢性ITP患者外周血中Th1，Th2和Th17細(xì)胞亞群的百分比：
　　與正常對照組相比，Th1和Th17細(xì)胞比例在慢性ITP患者外周血中顯著升高(Th1：19.38±9.18℅vs13.19±5.33℅, P=0.004；Th17：2.39±1.32℅vs1.07±0.51％, P<0.001)。而Th2細(xì)胞在慢性ITP患者外周血中顯著降低(Th2：1.15±0.52℅vs1.9

11、±0.64℅，P<0.001)。
　　3、IL-27細(xì)胞因子和Th1，Th2, Th17細(xì)胞亞群及外周血血小板計數(shù)的相關(guān)性：在慢性ITP患者外周血中, IL-27細(xì)胞因子和Th1細(xì)胞亞群呈正相關(guān)(r=0.733, P<0.001)，而與Th2，Th17，外周血血小板計數(shù)無相關(guān)性(Th2：r=－0.166, P=0.371；Th17：r=0.229, P=0.215；血小板計數(shù)：r=0.194, P=0.296)。
　　4、I

12、L-27，T-bet，GATA-3和RORγt mRNA在慢性ITP患者外周血中的表達(dá)：IL-27，T-bet和RORγt mRNA在慢性ITP患者中的相對定量表達(dá)比正常對照組明顯升高(IL-27：cITP3.46 fold vs control，P<0.05；T-bet：cITP7.37 fold vs control， P<0.05；RORγt：cITP11.1 fold vs control，P<0.05)。GATA-3 mRNA

13、在慢性ITP患者中的表達(dá)與正常對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　5、外源性重組人IL-27對慢性ITP患者PBMCs中Th1，Th2和Th17細(xì)胞的百分比的影響：
　　外源性重組人IL-27能上調(diào)Th1細(xì)胞百分比(慢性ITP患者：19.63±5.88%vs31.7±10.71%，P=0.007；正常對照：9.93±2.66%vs18.46±4.84%，P=0.002)，下調(diào)Th2細(xì)胞百分比(慢性ITP患者：1.1

14、5±0.21%vs0.96±0.18%，P=0.031；正常對照：2.15±0.49%vs1.68±0.40%，P=0.035)；外源性重組人IL-27能下調(diào)正常對照的Th17細(xì)胞百分比(1.38±0.45%vs0.81±0.35%, P=0.016)，但對慢性ITP患者Th17細(xì)胞無影響(2.41±0.57%vs2.33±0.4%, P=0.62)。
　　結(jié)論：
　　1、慢性ITP患者PBMCs中的IL-27 mRNA表達(dá)

15、水平和血漿中IL-27濃度明顯升高，提示IL-27可能參與了慢性ITP的發(fā)病過程。
　　2、慢性ITP患者PBMCs中的T-bet和RORγt mRNA表達(dá)水平和血漿中IFN-γ和IL-17A濃度明顯升高，同時慢性ITP患者外周血Th1和Th17細(xì)胞百分比上升，表明慢性ITP是Th1和Th17細(xì)胞占優(yōu)勢的疾病，細(xì)胞免疫異常是慢性ITP的重要發(fā)病機(jī)制之一。
　　3、慢性ITP患者血漿IL-27濃度和外周血Th1百分比成正比，外

16、源性重組人IL-27上調(diào)Th1細(xì)胞百分比，表明IL-27是通過促進(jìn)Th1細(xì)胞分化參與慢性ITP的發(fā)病機(jī)制。
　　研究背景：
　　原發(fā)性免疫性血小板減少性紫癜(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種自身免疫性出血性疾病，該病的臨床特點是患者體內(nèi)抗血小板自身抗體增多，導(dǎo)致結(jié)合了自身抗體的血小板被機(jī)體的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所清除，從而引起外周血血小板減少誘發(fā)皮膚黏膜或內(nèi)臟出血。其發(fā)病原因目前仍不

17、清楚，但確認(rèn)與免疫應(yīng)答異常有關(guān)。實驗研究表明，ITP的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞免疫功能異常密切相關(guān)。盡管B細(xì)胞過度增殖、活化產(chǎn)生針對血小板膜表面糖蛋白(glyeoprotein，Gp)Ⅱb/Ⅲa和GPIb/IX的自身抗體是ITP發(fā)病的直接原因，但T細(xì)胞亞群功能缺陷和比例失調(diào)導(dǎo)致B細(xì)胞被激活可能才是ITP發(fā)病的主要機(jī)制。目前的研究發(fā)現(xiàn)在ITP患者體內(nèi)，輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)1和Th2處于失衡狀態(tài)，Thl/Th2比例明顯上調(diào)

18、，Th17細(xì)胞數(shù)量增加，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞的數(shù)量減少和功能異常，但導(dǎo)致ITP患者T細(xì)胞分化異常的根本原因目前尚不清楚。
　　白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-12家族細(xì)胞因子是具有高度同源性的一類異源二聚體，包括IL-12，IL-23，IL-27和IL-35，它們主要由活化的抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(de

19、ndritic cell，DC)產(chǎn)生。IL-12通過活化STAT4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)促進(jìn)Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)；IL-23通過活化STAT3誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞；IL-27促進(jìn)早期Th1細(xì)胞分化并抑制Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞分化；IL-35可能是潛在的免疫抑制性細(xì)胞因子。由此可見，IL-12家族細(xì)胞因子對調(diào)節(jié)Th細(xì)胞分化發(fā)揮重要的作用，然而到目前為止，ITP患者中IL-12

20、家族細(xì)胞因子的表達(dá)情況及其在ITP發(fā)病中可能發(fā)揮的作用仍不清楚。
　　近期研究顯示，在慢性ITP治療過程中，大劑量地塞米松(high dosedexamethasone，HD-DXM)具有良好的治療效果及很高的安全性，可作為取代強(qiáng)的松(prednisone，Pred)作為治療ITP的一線治療方案。研究還發(fā)現(xiàn)：HD-DXM可以糾正ITP患者Th1細(xì)胞偏極，恢復(fù)Th1和Th2細(xì)胞因子之間的平衡，顯著提高CD4+CD25+Treg及叉頭

21、翼狀旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子(forkhead-winged helix transcriptionfactor，F(xiàn)oxP3)的表達(dá)。因此，在本研究中，我們比較了在慢性ITP患者和健康對照中血漿中IL-12家族細(xì)胞因子及其相關(guān)細(xì)胞因子的水平，并探討了其與各臨床參數(shù)之間的關(guān)系。同時還進(jìn)一步分析了HD-DXM治療對IL-12家族細(xì)胞因子的影響，以期初步探討IL-12家族細(xì)胞因子在慢性ITP發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　目的：
　　評價IL-12家

22、族細(xì)胞因子在慢性ITP發(fā)病機(jī)制中的作用和HD-DXM沖擊治療對IL-12家族細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響。
　　方法：
　　1.選擇慢性ITP患者31例,正常對照來自于36例健康志愿者。
　　2.所有慢性ITP患者口服或靜脈滴注DXM40 mg/d×4 d。
　　3. FlowCytomix技術(shù)檢測DXM治療前后血漿中IL-12p70，IL-23，IL-27，IFN-γ，IL-4和IL-17A水平。
　　4.酶聯(lián)

23、免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測DXM治療前后血漿中IL-35的水平。
　　結(jié)果：
　　1. HD-DXM臨床療效：
　　臨床觀察經(jīng)HD-DXM治療，19例慢性ITP患者達(dá)完全緩解，完全緩解率61.29%；6例患者部分緩解，部分緩解率19.35%；6例患者無效，無效率19.35%。治療過程中未見嚴(yán)重并發(fā)癥。
　　2. HD-DXM治療前血漿中細(xì)胞因

24、子的水平：
　　和正常對照相比，慢性ITP患者HD-DXM治療前血漿中的IL-12p70，IL-23，IL-27, IFN-γ和IL-17A細(xì)胞因子水平明顯升高(IL-12p70：27.32±8.19 vs14.21±6.23pg/ml， P<0.01；IL-23：789.25±340.52 vs477.42±141.65 pg/ml，P<0.01；IL-27：60.42±43.68 vs32.91±20.37 pg/ml，P=0

25、.001；IFN-γ：40.12±19.14 vs23.21±10.87 pg/ml, P<0.001；IL-17A：29.6±28.08 vs9.21±7.9 pg/ml, P<0.001)。而IL-4和IL-35在慢性ITP患者外周血中顯著降低(IL-4：57.69±17.71 vs78.7±29.82 pg/ml, P=0.001；IL-35：7.82±2.88 vs11.89±5.11 pg/ml，P<0.01)。
　　3

26、. HD-DXM治療后血漿中細(xì)胞因子的水平：
　　和HD-DXM治療前相比，慢性ITP患者HD-DXM治療后血漿中的IL-12p70,IL-23，IL-27，IFN-γ和IL-17A細(xì)胞因子水平明顯下降(IL-12p70：16.08±5.48 vs27.32±8.19 pg/ml，P<0.01；IL-23：517.54±166.67 vs789.25±340.52 pg/ml，P<0.01；IL-27：32.58±20.21 vs

27、60.42±43.68 pg/ml，P=0.001；IFN-γ：23.84±11.13 vs40.12±19.14 pg/ml，P<0.001；IL-17A：11.44±8.48 vs29.6±28.08 pg/ml，P<0.001)。而IL-4和IL-35細(xì)胞因子水平明顯上升(IL-4：77.74±20.70 vs57.69±17.71 pg/ml，P=0.001；IL-35：11.75±6.76 vs7.82±2.88 pg/ml，

28、P<0.01)。慢性ITP患者HD-DXM治療后血漿中各種細(xì)胞因子水平與正常對照無顯著差異(P>0.05)。
　　4. IL-12家族細(xì)胞因子與慢性ITP患者外周血血小板計數(shù)的相關(guān)性分析：
　　為了進(jìn)一步判定IL-12家族細(xì)胞因子與慢性ITP疾病進(jìn)展的關(guān)系，我們分析了IL-12家族細(xì)胞因子與慢性ITP患者外周血血小板計數(shù)的相關(guān)性。結(jié)果顯示：
　　HD-DXM治療前后IL-12p70和IL-23與慢性ITP患者外周血血小

29、板計數(shù)負(fù)相關(guān)(治療前：IL-12p70:r=-0.561，P<0.01;IL-23:r=-0.475，P<0.01；治療后：IL-12p70:r=-0.489，P<0.01;IL-23:r=-0.570，P<0.01）。本研究中我們未能發(fā)現(xiàn)IL-27和IL-35與慢性ITP患者外周血血小板計數(shù)的相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1. HD-DXM沖擊治療安全有效，可作為慢性ITP一線治療方案。
　　2.慢性ITP患者血漿中IF

30、N-γ和IL-17A水平明顯升高，IL-4水平下降，說明慢性ITP是一種Th1和Th17細(xì)胞占優(yōu)勢的疾病，HD-DXM治療后各種細(xì)胞因子水平恢復(fù)正常，提示HD-DXM能恢復(fù)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)之間的平衡。
　　3.慢性ITP患者血漿中IL-12，IL-23和IL-27水平明顯升高，IL-35水平減少，HD-DXM治療后IL-12家族細(xì)胞因子水平恢復(fù)正常，提示作為一種免疫抑制劑， DXM可能部分是通過調(diào)節(jié)IL-12家族細(xì)胞因子水平控制慢性I