球孢白僵菌熱激蛋白家族、Ca2+ATP激酶Pmr1、磷酸化酶Cdc14及腺苷酸環(huán)化酶的功能解析.pdf

1、球孢白僵菌是廣泛用于農(nóng)林害蟲生物防治的絲狀昆蟲病原真菌(filamentousentomopathogen)，其田間應(yīng)用往往受到各種環(huán)境因素的制約。探索生防真菌的抗逆生物學(xué)機制，并用于菌種遺傳性狀的維護和改良，是利用真菌開展害蟲生物防治的理論和技術(shù)基礎(chǔ)。
　　本論文主要研究了球孢白僵菌熱激蛋白家族、鈣離子ATP激酶家族、磷酸化酶Cdc14以及腺苷酸環(huán)化酶的抗逆生物學(xué)功能及其對毒力貢獻，并嘗試解析可能的分子調(diào)控機制。主要研究內(nèi)容和成

2、果概述如下:
　　球孢白僵菌熱激蛋白家族的功能解析熱激蛋白HSP(heat shock proteins)是生物體在脅迫條件下大量合成的一類蛋白，家族成員眾多，根據(jù)分子量大小分為sHsp（小熱激蛋白）、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90及Hsp100六個亞家族。與酵母HSP及其熱激轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列比對，球孢白僵菌基因組編碼的HSP蛋白多達30個，包括3個sHsp，6個Hsp40，2個Hsp60，15個Hsp70，1個

3、Hsp82，1個Hsp90，2個Hsp100及3個類似熱激轉(zhuǎn)錄因子的蛋白Hsf1～3。通過構(gòu)建和分析各Hsp和Hsf的單基因敲除菌株和回補菌株并與野生型進行比較，發(fā)現(xiàn)它們對宿主菌的生長、產(chǎn)孢、營養(yǎng)利用、多脅迫反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、侵染力及胞內(nèi)物質(zhì)代謝等諸方面扮演著或舉足輕重或影響顯著的角色。其中，sHsp基因的缺失導(dǎo)致菌落生長受到抑制和對氧化、胞壁干擾、多菌靈、高溫及UV-B紫外輻射的敏感性升高，并伴隨毒力的小幅下降。Hsp40基因的敲除導(dǎo)致

4、生長緩慢(△hsp40a及△hsp40c的生長被抑制40％以上)，產(chǎn)孢量下降（以△hsp40c為最），抗氧化、高滲、胞壁干擾、多菌靈、高溫及UV-B輻射脅迫的能力及侵染力顯著降低，其中△40a的高滲敏感性升高70％，完全喪失經(jīng)體壁侵染大蠟螟幼蟲的能力。Hsp60基因參與正向調(diào)控產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答反應(yīng)及侵染力，其中△hsp60a的孢子梗分化受阻且數(shù)目稀少，使分生孢子產(chǎn)量大幅下降。Hsp70亞家族有9個基因是敲除致死的，6個基因的缺失導(dǎo)致生長

5、、產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答及生防潛能指標(biāo)小幅下降。Hsp90基因也是敲除致死的，而Hsp82基因的缺失導(dǎo)致產(chǎn)孢量、多脅迫應(yīng)答和生防潛能指標(biāo)的下降。Hsp100基因的敲除對生長、產(chǎn)孢、多脅迫應(yīng)答及生防潛能指標(biāo)具有重要影響，敲除株表現(xiàn)產(chǎn)孢、耐高溫能力及侵染力的嚴(yán)重缺陷。3個Hsf基因的敲除導(dǎo)致不同的表現(xiàn)變化。△Hsf1的產(chǎn)孢量顯著下降，抗氧化、抗胞壁干擾、耐高溫、抗多菌的能力下降25～78％;△Hsf2表現(xiàn)嚴(yán)重的生長、產(chǎn)孢和侵染力缺陷，對氧化、高滲

6、及胞壁脅迫的敏感性升高，但對多菌靈的抗性增強43％?！鱄sf3僅表現(xiàn)輕微的生長缺陷，但產(chǎn)孢量和抗胞壁脅迫的能力大幅下降，對氧化及多菌靈的敏感性和抗高滲能力小幅上升，而抗紫外輻射能力和侵染力明顯下降。各熱激蛋白和轉(zhuǎn)錄因子還對細(xì)胞內(nèi)甘油、海藻糖及甘露醇的含量以及酸堿度平衡也具有重要影響，且彼此之間存在冗余、互補及調(diào)控的關(guān)系。綜合看，Hsf1、Hsp78和Hsp104是重要的熱敏因子，Hsf1也是重要的孢壁完整性維持因子，Hsp40a是重要的

7、滲透壓敏感因子和毒力因子，Hsf2、Hsf3、Hsp78、Hsp60a及Hsp40c是重要的產(chǎn)孢調(diào)控因子。
　　球孢白僵菌P型鈣離子ATP激酶Bbpmr1的功能分析真核生物P型鈣離子ATP激酶Pmr1是鈣離子—鈣調(diào)蛋白信號通路中的重要元件，但其通過與其它信號通路的相互作用而控制細(xì)胞的生理過程罕見研究報道。通過分析位于球孢白僵菌高爾基體中Pmr1(Bbpmr1)的結(jié)構(gòu)特征并對其缺失菌株進行正常和脅迫條件下的多表型及轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)Bb

8、pmr1基因的缺失導(dǎo)致營養(yǎng)利用、生長、產(chǎn)孢及萌發(fā)等諸多嚴(yán)重缺陷。缺失株對氧化、高滲、胞壁干擾、殺菌劑及金屬離子等脅迫的敏感性顯著升高，其分子孢子耐高溫能力、抗UV-B紫外輻射的能力及毒力均損失一半左右。伴隨多表型的變化，敲除菌株中無性發(fā)育相關(guān)4個基因的轉(zhuǎn)錄水平較對照菌株下調(diào)75％以上，而且多個信號通路相關(guān)基因（各MAPK通路中的級聯(lián)基因、Ras、Ssk1、TOR信號通路）及下游效應(yīng)基因在不同類型化學(xué)脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平都大幅下調(diào)。結(jié)果表明，

9、Bbpmr1通過多條信號通路的功能對話正向調(diào)控球孢白僵菌的生長、產(chǎn)孢、多脅迫耐受力及侵染力。
　　球孢白僵菌磷酸化酶Cdc14的功能及其細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)樞紐作用球孢白僵菌Cdc14磷酸化酶被證明定位于細(xì)胞核內(nèi)。Cdc14的失活導(dǎo)致13％的細(xì)胞形成三個或三個以上的細(xì)胞核且芽生孢子產(chǎn)量下降89％，表明胞質(zhì)分裂嚴(yán)重受損。因此，△cdc14表現(xiàn)營養(yǎng)利用和菌落生長的嚴(yán)重缺陷，分生孢子產(chǎn)量大幅下降。這些表型與若干細(xì)胞分裂和產(chǎn)孢相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達受

10、抑制是一致的。而且，△cdc14在菌落生長期間對氧化、滲透壓、胞壁干擾及殺菌劑脅迫都更加敏感，其分生孢子的耐高溫能力、抗UV-B紫外輻射的能力及侵染力下降41～70％。這些抗逆表型的變化與61個細(xì)胞信號傳導(dǎo)(MAPK級聯(lián)基因、Ras1/Ras2、PKA/PKC及Snf1)、抗氧化、耐高滲和胞壁完整性相關(guān)的效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化基本一致。有趣的是，ELISA實驗結(jié)果顯示，敲除菌株中Hog1及Slt2的磷酸化水平在不同化學(xué)脅迫條件下都大幅下

11、調(diào)。由此說明，Cdc14作為信號網(wǎng)絡(luò)的樞紐而調(diào)控球孢白僵菌的胞質(zhì)分裂、生長發(fā)育、多脅迫應(yīng)答反應(yīng)及毒力。
　　腺苷酸環(huán)化酶在球孢白僵菌及羅伯茨綠僵菌中的功能比較腺苷酸環(huán)化酶(AC)是真菌cAMP信號通路中的一個關(guān)鍵元件。球孢白僵菌及羅伯茨綠僵菌(Metarhiziumrobertsii)各有一個結(jié)構(gòu)相似但功能分化的AC，分別為BbAC和MrAC。兩個AC蛋白的失活都導(dǎo)致在富營養(yǎng)和貧瘠營養(yǎng)基質(zhì)上的菌落生長放慢，但在富營養(yǎng)平板上的產(chǎn)孢量

12、變化趨勢相反，即培養(yǎng)期間△BbAC的分生孢子產(chǎn)量提高48％～1.1倍，而△MrAC的產(chǎn)孢量卻下降52～68％。兩個敲除菌株的生長缺陷可通過在培養(yǎng)基中添加cAMP而部分緩解。△BbAC對氧化、高滲、胞壁干擾、多菌靈及幾種金屬離子（Cu2+除外）脅迫都更敏感，而△MrAC更抗高滲脅迫，且對剛果紅和多菌靈脅迫無明顯應(yīng)答反應(yīng)。在對敏感寄主的標(biāo)準(zhǔn)化侵染處理中，△BbAC的半致死時間比對照菌株延長10.9 d，而△MrAC只延長1.4 d。這些結(jié)果