禾谷鐮刀菌激酶組代謝譜和腺苷酸環(huán)化相關(guān)蛋白FgCap1功能研究.pdf

1、由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）為主要病原所引起的小麥赤霉病是世界范圍內(nèi)小麥產(chǎn)區(qū)的主要病害之一。該病不但能造成小麥產(chǎn)量的巨大損失，還能在侵染致病過程中產(chǎn)生名為脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)危害人畜的健康。前面的研究中已經(jīng)獲得96個禾谷鐮刀菌激酶基因缺失突變體，這些激酶中28個基因在釀酒酵母中無同源基因，其中12個沒有觀察到明顯的表型變化。這些沒有表型變化的基因推測可能在胞內(nèi)代謝通路上發(fā)生變化從而引起菌體代謝物。代謝

2、組學(xué)的中心目的就是在特定的環(huán)境條件下分析由基因調(diào)控所引起的生物系統(tǒng)中代謝產(chǎn)物的變化，因此代謝組學(xué)可以將基因型和表型同代謝物聯(lián)系起來。在本研究中，我們通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)分析93個激酶缺失突變體中代謝譜變化。在基本培養(yǎng)基(MM)和完全培養(yǎng)基(CM)中培養(yǎng)15天的所有突變體，通過濾布過濾菌絲后液氮研磨。研磨后樣品使用甲醇提取，代謝物通過氯甲酸甲酯(MCF)三甲基硅烷(TMS)和衍生化。與MM培養(yǎng)的菌絲相比，在CM中的菌絲產(chǎn)生更

3、多的亞油酸、山梨醇和蔗糖，但是阿拉伯糖醇的產(chǎn)量降低。此外，MM培養(yǎng)基中無明顯的代謝譜變化的突變體在CM中也表現(xiàn)出巨大的代謝變化，表明培養(yǎng)條件和基因調(diào)控共同影響代謝物種類和含量。禾谷鐮刀菌中重要的三條MAPK通路在植物侵染和其他很多生物過程中扮演著重要的作用。FgHog1通路突變體在兩種培養(yǎng)基中相對于野生型PH-1都顯示出阿拉伯糖醇和山梨醇顯著降低并聚類在一起。FgMgv1通路缺失突變體在MM中和FgGpmk1通路缺失突變體聚類在一起。有

4、趣的是，在CM中FgMgv1通路缺失突變體和其他11個基因缺失突變體相對于野生型表現(xiàn)出極其明顯的阿拉伯糖醇的升高和松二糖降低并聚類在一起。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該通路缺失突變體影響了甘油脂類代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)變和半乳糖代謝。OPLS-DA分析發(fā)現(xiàn)有性生殖與野生型PH-1無明顯差異的突變體和不產(chǎn)生子囊殼的突變體之間有著明顯的區(qū)分，表明這兩個組別的突變體間有著相對明顯的代謝譜差異，進一步鑒定出14個VIP值大于1的代謝產(chǎn)物對這兩組差異貢獻最大

5、。對12個無明顯表型的基因突變體分析發(fā)現(xiàn)三個在代謝譜上有明顯的變化，此三個突變體主要影響碳代謝過程。準確定義這三個基因在代謝中的功能需要更多的數(shù)據(jù)支持。
　　單端孢霉烯毒素合成基因(TRI)的表達以及DON的產(chǎn)生受到環(huán)腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A(cAMP-PKA)通路和兩個通路特異轉(zhuǎn)錄因子（TRI6和TRI10）的調(diào)控。有趣的是，TRI6基因缺失突變體中cAMP通路多個組分表達下降，包括在禾谷鐮刀菌中還未報道的腺苷酸結(jié)合蛋白基因Fg

6、CAP1。在本研究中，我們證明了FgCap1與腺苷酸環(huán)化酶(Fac1)互作，在缺失FgCAP1的時候細胞內(nèi)cAMP和PKA活性顯著下降。Fgcap1缺失突變體在營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢和致病力方面有著明顯的下降。同時突變體在DON產(chǎn)量和TRI基因的表達上也顯著下降，這一表型可以通過加入外源cAMP得到恢復(fù)，這也表明FgCap1是依靠PKA調(diào)控DON合成。野生型在DON產(chǎn)毒誘導(dǎo)條件下cAMP和FgCAP1的表達升高但是在tri6突變體中則不然。此外

7、，在FgCAP1的啟動子區(qū)域含有一個可能的TRI6結(jié)合位點，該位點對于DON合成有著重要的作用，但是這一位點對于菌絲生長、產(chǎn)孢和致病沒有影響。此外，F(xiàn)gCap1表現(xiàn)出和肌動蛋白的定位相似位于菌絲生長頂端。磷酸化蛋白組分析鑒定出FgCap1的磷酸化位點S353。FgCAP1的S353點突變獲得的突變體S353A在營養(yǎng)生長、產(chǎn)孢和DON產(chǎn)生方面都沒有影響。但是，F(xiàn)gCAP1S353A等位基因的表達不能夠互補Fgcap1突變體在植物侵染中的作