甘薯腺苷酸激酶基因的克隆分析及載體構(gòu)建.pdf

1、甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)是全世界的主要農(nóng)作物之一和重要的淀粉作物?，F(xiàn)代生物技術和基因工程技術的發(fā)展為獲取高淀粉甘薯新品種提供了可能，其前提是對其淀粉代謝途徑的深入研究。 腺苷酸激酶(EC.2.7.4.3，adenylate kinaSe，ADK)催化ATP和AMP合成兩分子ADP的可逆反應，是調(diào)控這三種前體分子在淀粉代謝庫和核酸代謝庫中分配的關鍵酶。為研究ADK在甘薯淀粉合成中的作用以及為甘薯淀粉代謝

2、工程提供候選基因，本研究采用RACE技術從自有淀粉專用型甘薯新品種“渝蘇303”(國審薯2002006)中克隆了ADK基因cDNA全長(IbADK，GellBank 登錄號：EF562533)，并對該基因及其所編碼的ADK蛋白進行了詳盡的生物信息學分析和組織表達譜分析。獲得結(jié)果如下：根據(jù)已知腺苷酸激酶基因的保守序列設計引物，擴增獲得592bp的核心片段；BLAST分析表明該片段與其它植物ADK同源，初步確定為甘薯的ADK基因核心片段；根

3、據(jù)該序列設計用于3’-RAcE和5’-RAcE的基因特異性引物，擴增獲得548bp的3’-末端和3 14bp的5’-末端：將核心片段、3’-末端和5’-末端序列進行拼接，獲得甘薯ADK基因的cDNA電子全長，進而設計引物擴增獲得其物理全長。IbADK全長1314bp，其編碼區(qū)長度為855 bp，編碼長度為284個氨基酸殘基的ADK蛋白(IbADK)；生物信息學預測IbADK分子量為30.86 kDa，等電點為6.46；BLAST分析顯示

4、IbADK與馬鈴薯ADK序列相似性達到83％；亞細胞定位預測lbADK的N-端有一段長度為22個氨基酸殘基的質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽，表明該蛋白定位于質(zhì)體，這與淀粉合成定位于質(zhì)體相一致；將IbADK與植物ADKs構(gòu)建分子發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯ADK蛋白與IbADK聚為一類，表明兩者在進化上比較接近，這與BLAST結(jié)果相符；對IbADK進行二級結(jié)構(gòu)預測，表明其中包含26.06％的α-螺旋、23.59％ 的片層和50.35％的隨機卷曲；進一步對IbA

5、DK進行三維結(jié)構(gòu)建模，表明該蛋白能夠正常折疊形成典型的ADK蛋白三維結(jié)構(gòu)，并在其三維結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了AMP結(jié)合位點和ATP-AMP(Ap5A)結(jié)合位點；利用半定量 RT-PCR技術對IbADK進行組織表達譜分析，表明該基因在塊根和幼葉中表達量最高，在成熟葉片和莖中表達量次之，在葉柄中則檢測不到IbADK的表達。已有研究表明，淀粉合成定位于兩種質(zhì)體，即葉片中的葉綠體和塊根中的淀粉體。因此在甘薯塊根和幼葉中IbADK的高表達，有利于促進這兩種代

6、謝活躍的組織中ATP、AMP和ADP分子的代謝，進而調(diào)節(jié)淀粉代謝和核苷酸代謝。對IbADK的克隆分析和性質(zhì)研究，有助于在分子遺傳學水平上了解IbADK的功能，并且對于研究甘薯淀粉合成的分子機理有一定幫助。 前人研究表明：適當下調(diào)ADK表達量，可以促使腺苷酸代謝庫向淀粉合成的方向流動。本研究設計一對帶酶切位點的引物，克隆IbADK的編碼區(qū)，反向插入到植物表達載體pHB中，構(gòu)建IbADK反義表達載體pHB-albADK，同時構(gòu)建正義