腺苷酸環(huán)化酶激活劑誘導(dǎo)脆性X智力低下一號(hào)基因重新表達(dá)的機(jī)制研究.pdf

1、脆性X綜合征[fragile X syndrome，F(xiàn)ra(X)]是最常見的遺傳性智力低下疾病之一。據(jù)保守估計(jì)，我國至少有20萬脆性X病人。目前認(rèn)為Fra(X)致病機(jī)制主要是由于脆性X智力低下一號(hào)基因(fragile X mental retardation-1 gene，F(xiàn)MR1)啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)(CGG)n三核苷酸重復(fù)序列的不穩(wěn)定擴(kuò)增及其上游的CPG島的異常甲基化，使FMR1基因轉(zhuǎn)錄及翻譯終止，其編碼產(chǎn)物—脆性X智力低下蛋白(fragil

2、e X mental retardation protein，F(xiàn)MRP)減少或缺如，最終表現(xiàn)為Fra(X)。目前對(duì)于Fra(X)的治療尚無有效的方法，基因治療仍困難重重，藥物重新活化FMR1的方法，也因其存在較強(qiáng)的毒副作用制約了臨床應(yīng)用，尋找有效、安全、低/無毒副作用的藥物用于治療Fra(X)仍是目前研究的熱點(diǎn)之一。
　　 已往很多研究提示智力低下與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之間有著某種相互聯(lián)系，其中，環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosi

3、ne monophosphate，cAMP)信號(hào)通路與學(xué)習(xí)記憶和智力關(guān)系最為密切，故Fra(X)與cAMP通路之間的關(guān)系也引起了人們的密切關(guān)注。人們發(fā)現(xiàn)在Fra(X)患者細(xì)胞中、在FMR1基因敲除小鼠的腦組織及血小板內(nèi)，以及在患有Fra(X)的果蠅腦組織內(nèi)cAMP水平均低于正常，而患有Fra(X)的果蠅可以通過重新植入FMR1基因來彌補(bǔ)這種缺陷，由此提示FMR1基因與cAMP之間可能存在相互調(diào)控關(guān)系。
　　 Fra(X)患者細(xì)胞

4、內(nèi)cAMP水平降低的原因是什么呢？cAMP的代謝主要與腺苷酸環(huán)化酶（adenylate cyclase，AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）的活性有關(guān)。前者作用于ATP可生成cAMP，而后者則降解cAMP，以保持胞內(nèi)cAMP水平的平衡。有臨床研究發(fā)現(xiàn)一部分Fra(X)患者存在腺苷酸環(huán)化酶催化亞單位的功能或者調(diào)節(jié)的異常。我們前期研究發(fā)現(xiàn)FMR1基因封閉后細(xì)胞內(nèi)cAMP水平下降，腺苷酸環(huán)化酶活性也明顯降低，而磷酸

5、二酯酶的活性則無顯著變化。提示FMR1基因的功能缺陷可影響腺苷酸環(huán)化酶的活性，推測(cè)腺苷酸環(huán)化酶活性抑制可能是影響Fra(X)患者細(xì)胞內(nèi)cAMP水平降低的主要原因。
　　 如果FMR1基因轉(zhuǎn)錄及翻譯終止與腺苷酸環(huán)化酶活性降低有關(guān)，反之，用藥物提高腺苷酸環(huán)化酶的活性能否重啟被封閉的FMR1基因呢？為了證明我們的猜想，前期在封閉的FMR1基因細(xì)胞模型上，我們采用特異性腺苷酸環(huán)化酶(AC)激活劑藥物弗司可林(forskolin，F(xiàn)SK)

6、改善腺苷酸環(huán)化酶的低活性狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它的確可有效地重新誘導(dǎo)沉默F(xiàn)MR1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，但forskolin對(duì)FMR1基因調(diào)節(jié)的具體機(jī)制尚不清楚，是否通過提高cAMP水平這一途徑誘導(dǎo)的有待進(jìn)一步證實(shí)。
　　 已知FMRI基因啟動(dòng)子區(qū)與FMR1基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，該區(qū)內(nèi)存在一個(gè)具有增強(qiáng)子活性的甲基化敏感區(qū)(methylation sensitive element，MSE)，值得注意的是該區(qū)增強(qiáng)子內(nèi)又同時(shí)包含一個(gè)cAMP反應(yīng)

7、單位(cAMP-responsive element，CRE)堿基序列，兩者結(jié)構(gòu)重疊，關(guān)系緊密。而CRE序列是環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)單元結(jié)合蛋白(CREB)的結(jié)合位點(diǎn)。CREB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)包括記憶功能在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能，且研究發(fā)現(xiàn)CREB可以與FMR1啟動(dòng)子結(jié)合并可增強(qiáng)FMR1啟動(dòng)子的活性，因此推測(cè)其機(jī)制可能是cAMP誘導(dǎo)的。AC激動(dòng)劑forskolin是否經(jīng)cAMP通路，通過FMR1啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MSE/CRE重疊位點(diǎn)實(shí)

8、現(xiàn)對(duì)FMR1基因調(diào)節(jié)的尚有待證實(shí)。
　　 為了證實(shí)以上推測(cè)，本研究1.擬直接采用外源性cAMP藥物-二丁酰環(huán)磷酸腺苷(db-cAMP)誘導(dǎo)沉默F(xiàn)MR1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，試圖證實(shí)forskolin是通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平這一途徑而達(dá)到對(duì)FMR1基因再激活作用的;2.以MSE/CRE位點(diǎn)為研究靶點(diǎn)，構(gòu)建FMR1啟動(dòng)子區(qū)MSE/CRE位點(diǎn)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，在不影響MSE整體啟動(dòng)子活性的情況下，分別突變CRE序列，形成突變

9、啟動(dòng)子M1、M2的雙熒光素酶報(bào)告基因，試圖驗(yàn)證forskolin是經(jīng)FMR1啟動(dòng)子區(qū)MSE/CRE位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)FMR1基因的調(diào)節(jié)，為進(jìn)一步研究AC激動(dòng)劑forskolin重啟FMR1基因的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，試圖為Fra(X)患者的治療提供新的思路和治療前景。
　　 研究方法:
　　 1.制作pc12細(xì)胞FMR1基因封閉的細(xì)胞模型采用硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)封閉FMR1基因。硝普鈉為經(jīng)典的一氧

10、化氮(nitric oxide，NO)供體，可通過產(chǎn)生的NO活化DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA MeTase)，從而使FMR1啟動(dòng)子區(qū)CpG島的MSE中的胞嘧啶發(fā)生高度甲基化，阻斷了核酸因子與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制了FMR1 mRNA的轉(zhuǎn)錄。最后通過real-time PCR觀察FMR1基因的封閉效果。
　　 2.觀察二丁酰環(huán)磷酸腺苷(db-cAMP)對(duì)pc12細(xì)胞FMR1mRNA的影響1000umol/LSNP作用pc12細(xì)胞24h后，

11、實(shí)驗(yàn)組分別加入濃度為0.25mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L的db-cAMP，分別于db-cAMP作用6h、12h、24h、48h后收集細(xì)胞，提取總RNA。以正常的pc12細(xì)胞為正常對(duì)照組，以僅加SNP作用的pc12細(xì)胞為封閉抑制對(duì)照組，用熒光定量PCR(染料法)檢測(cè)FMR1基因的表達(dá)情況。
　　 3.觀察二丁酰環(huán)磷酸腺苷(db-cAMP)對(duì)FMR1蛋白水平(FMRP)的影響
　　 硝普鈉封閉pc12細(xì)胞

12、FMR124h后，加入0.5mmol/Ldb-cAMP，分別于加藥24h、48h、72h、96h后收集細(xì)胞（12小時(shí)補(bǔ)充失效的db-cAMP，48小時(shí)補(bǔ)充失效的SNP），提取蛋白質(zhì)，進(jìn)行WesternBlot，對(duì)FMRP進(jìn)行半定量分析。
　　 4.FMR1啟動(dòng)子MSE/CER重疊序列及突變CRE雙熒光素酶報(bào)告基因的構(gòu)建
　　 采用PCR的方法從K562細(xì)胞DNA中釣取MSE/CRE重疊序列，然后采用PCR點(diǎn)突變的方法分別

13、突變CRE序列，形成突變子M1、M2，分別獲得MSE、M1、M2片段，然后連接到PGL3載體上，進(jìn)而轉(zhuǎn)化到DH5a細(xì)胞中，提取質(zhì)粒。MSE/PGL3、M1/PGL3、M2/PGL3分別與海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染pc12細(xì)胞后，對(duì)所測(cè)熒光素酶活性強(qiáng)度值進(jìn)行分析。
　　 5.驗(yàn)證CRE位點(diǎn)是腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin重啟FMR1基因的關(guān)鍵位點(diǎn)
　　 從DH5a細(xì)菌中提取MSE/PGL3、M1/PGL3、M2/PGL3質(zhì)粒，分

14、別轉(zhuǎn)染pc12細(xì)胞后進(jìn)行分組，加1000umol/LSNP和（或）50umol/Lforskolin，檢測(cè)熒光素酶活性，比較在正常CRE與突變后CRE狀態(tài)下，forskolin對(duì)FMR1基因開啟的影響，通過對(duì)熒光素酶值的比較，判斷啟動(dòng)子活性（熒光素酶值高，啟動(dòng)子活性則高;反之，則低），以此驗(yàn)證CRE位點(diǎn)是否是腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin重啟FMR1基因的關(guān)鍵位點(diǎn)。
　　 6.統(tǒng)計(jì)
　　 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13

15、.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差((X)±s)表示。熒光定量PCR結(jié)果采用2-△△CT值分析，采用單因素方差分析;因方差不齊，組間兩兩比較采用DunnettT3;與正常組的比較采用單樣本t檢驗(yàn)。WesternBlot數(shù)據(jù)采用Bia-RadGel-ProAnalyzer軟件分析所得A值之比，因方差齊性，組間兩兩比較采用LSD;相對(duì)熒光素酶活性檢測(cè)數(shù)據(jù)應(yīng)用相對(duì)熒光素酶活性強(qiáng)度值分析，采用析因設(shè)計(jì)資料方差分析，因方差齊性，組間兩

16、兩比較采用LSD。p＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 研究結(jié)果
　　 1.不同濃度及不同時(shí)間點(diǎn)db-cAMP對(duì)封閉的FMR1轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 db-cAMP在0.5mmol/L作用12h時(shí)FMR1mRNA激活效果最強(qiáng)，F(xiàn)MR1mRNA的表達(dá)量約為封閉組的9.7倍(P＜0.05)，約為正常組的0.86倍(P=0.135)。0.5mmol/Ldb-cAMP的激活效果維持時(shí)間小于18小時(shí)。
　　 2.db

17、-cAMP對(duì)FMRP表達(dá)的影響
　　 用SNP1000μmol/L封閉FMR1基因，作用72h時(shí)FMRP表達(dá)量最低，約為正常組的0.56倍;在SNP封閉的基礎(chǔ)上，加入0.5mmol/Ldb-cAMP可提高FMRP表達(dá)量，作用72h時(shí)激活效果最好，為正常組的0.98倍(P＜0.05)，是封閉組的1.25倍(P＜0.05)。
　　 3.熒光素酶載體構(gòu)建
　　 PCR、雙酶切驗(yàn)證后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均符合設(shè)計(jì)。pGL-3

18、/MSE位、pGL-3/M1位、pGL-3/M2位質(zhì)粒、pGL3basic與海腎質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染pc12細(xì)胞，質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)入pc12細(xì)胞，并且具有啟動(dòng)子活性，顯示脆性X智力低下一號(hào)基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建成功。
　　 4、腺苷酸環(huán)化酶激活劑forskolin重啟FMR1基因CRE位點(diǎn)驗(yàn)證
　　 (1)經(jīng)SNP封閉作用后，MSE位、M1位、M2位三組與未加SNP的各自正常對(duì)照組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示

19、經(jīng)SNP作用，三組FMR1均被SNP封閉成功。
　　 (2)未經(jīng)SNP封閉，單經(jīng)forskolin處理后，MSE位、M1位、M2位三組分別與各自的對(duì)照組相比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示forskolin對(duì)正?；钚缘腇MR1啟動(dòng)子，無論CRE序列結(jié)構(gòu)正常或突變，均無增強(qiáng)作用。
　　 (3)已被SNP封閉后的FMR1，再添加forskolin處理，當(dāng)CRE位點(diǎn)正常時(shí)，MSE組的熒光素酶活性顯著高于未添加forsko

20、lin的封閉對(duì)照組(P＜0.05);在突變了CRE結(jié)合位點(diǎn)的M1組和M2組中，添加forskolin組與未添加forskolin封閉對(duì)照組均無顯著性差異(P＞0.05)。由此提示，當(dāng)FMR1啟動(dòng)子活性低下時(shí)，在CRE結(jié)構(gòu)正常情況下，forskolin可開啟封閉的FMR1基因，而當(dāng)突變CRE序列后，forskolin對(duì)FMR1封閉基因的開啟作用則消失。
　　 以上結(jié)果顯示當(dāng)CRE位點(diǎn)正常時(shí)，forskolin對(duì)活性低下的FMR1啟

21、動(dòng)子有顯著地激活作用，而對(duì)正?；钚缘腇MR1啟動(dòng)子則無增強(qiáng)作用;當(dāng)CRE位點(diǎn)突變之后，forskolin對(duì)正?；钚浴⒌拖禄钚缘腇MR1啟動(dòng)子均無開啟作用。
　　 結(jié)論
　　 1.發(fā)現(xiàn)直接采用外源性環(huán)磷酸腺苷(db-cAMP)也可有效地重新誘導(dǎo)被封閉的FMR1基因和蛋白表達(dá)，這有望為Fra(X)發(fā)病機(jī)制的研究和臨床治療提供新的思路和治療前景。
　　 2.證實(shí)了cAMP激活劑forskolin開啟FMR1封閉基因的機(jī)

22、制之一是通過提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平而實(shí)現(xiàn)的。
　　 3.成功構(gòu)建FMR1啟動(dòng)子區(qū)MSE/CRE位點(diǎn)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，結(jié)果顯示當(dāng)CRE位點(diǎn)正常時(shí)，forskolin對(duì)活性低下的FMR1啟動(dòng)子有顯著地激活作用，而當(dāng)CRE位點(diǎn)突變之后，forskolin則無此作用，由此證實(shí)CRE位點(diǎn)是forskolin重啟FMR1基因的關(guān)鍵位點(diǎn)。推測(cè)AC激動(dòng)劑forskolin可能主要是通過FMR1啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的MSE/CRE重疊位點(diǎn)，經(jīng)cAMP