腺苷酸環(huán)化酶Ⅲ(AC3)在非神經(jīng)細(xì)胞中定位的研究.pdf

1、cAMP作為細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使之一,調(diào)節(jié)細(xì)胞的許多生物學(xué)功能,包括卵子發(fā)生、胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育、荷爾蒙分泌、糖代謝、平滑肌收縮、心臟收縮、嗅覺(jué)、學(xué)習(xí)以及記憶等。
　　腺苷酸環(huán)化酶(AC)是cAMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組分,其主要作用是催化ATP生成cAMP。AC3是AC家族中的第3個(gè)成員,它是已分離、鑒定的其中9個(gè)膜整合蛋白之一。研究發(fā)現(xiàn)AC3不僅表達(dá)于小鼠海馬區(qū)、下丘腦和嗅覺(jué)表皮組織等部位的神經(jīng)細(xì)胞纖毛,還廣泛存在于脊髓、腎上

2、腺髓質(zhì)和皮質(zhì)、心房肌、主動(dòng)脈平滑肌、肺、腎、胰島、睪丸和卵巢等多種組織器官,并與多種生理功能密切相關(guān)。
　　纖毛是突出于真核細(xì)胞表面的、以微管為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的“毛發(fā)狀”細(xì)胞器,它能感知細(xì)胞外機(jī)械和化學(xué)信號(hào)刺激。纖毛分為兩大類(lèi):運(yùn)動(dòng)纖毛和不動(dòng)纖毛,不動(dòng)纖毛即初級(jí)纖毛,它普遍存在于多種生物的各種類(lèi)型細(xì)胞表面。初級(jí)纖毛上含有多種特異受體、離子通道蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白等。近年發(fā)現(xiàn)初級(jí)纖毛參與了細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)等多種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程,對(duì)動(dòng)物的發(fā)育調(diào)控

3、及維持各個(gè)組織器官正常生理功能具有重要作用。
　　盡管AC3表達(dá)在多種非神經(jīng)細(xì)胞中并具有重要的生理功能,但它在這些非神經(jīng)細(xì)胞的表達(dá)部位,尚待確定。本研究旨在明確AC3在這些非神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)情況以及表達(dá)部位。
　　本論文以大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤PC12、人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、小鼠腎內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞IMCD3、人腎上皮細(xì)胞293T、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞BMSCs、成骨細(xì)胞OB、人宮頸癌細(xì)胞HeLa和人肺癌細(xì)胞A549為研究材料。研究的

4、內(nèi)容主要分為2個(gè)部分:
　　第一部分通過(guò)RT-PCR技術(shù)對(duì)細(xì)胞的AC3基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行半定量,PCR產(chǎn)物DNA測(cè)序,所得序列用生物學(xué)軟件DNAMAN6.0分別將人和鼠的AC3基因 cDNA進(jìn)行比對(duì)分析。
　　第二部分:運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光染色,對(duì)PC12、U251、IMCD3、293T、OB和BMSC以及A549和HeLa細(xì)胞中AC3的表達(dá)部位進(jìn)行確定。
　　研究結(jié)果如下:
　　1、以AC3基因的特異性引物,

5、擴(kuò)增并檢測(cè)AC3基因在相關(guān)細(xì)胞中有擴(kuò)增產(chǎn)物,對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序并進(jìn)行比對(duì)分析顯示,這些細(xì)胞中均有AC3基因的內(nèi)源性表達(dá)。
　　2、免疫熒光染色結(jié)果顯示PC12和U251細(xì)胞株中均發(fā)現(xiàn)了陽(yáng)性標(biāo)記的AC3抗體,并與纖毛標(biāo)記抗體Acetylatedα-Tubulin染色發(fā)生重疊。小鼠IMCD3細(xì)胞株和人腎組織的293T細(xì)胞中大多細(xì)胞具有初級(jí)纖毛亞結(jié)構(gòu),且AC3亞定位于該細(xì)胞的纖毛部位,在這兩種腎細(xì)胞中,AC3表達(dá)于初級(jí)纖毛。BMSC細(xì)胞中

6、能直觀地觀察到AC3亞定位于初級(jí)纖毛上。在A549細(xì)胞中AC3陽(yáng)性結(jié)果與初級(jí)纖毛標(biāo)記物Acetylatedα-Tubulin陽(yáng)性結(jié)果完全重合,且AC3沿著初級(jí)纖毛軸絲分布;在 HeLa細(xì)胞中初級(jí)纖毛與AC3的分布情況類(lèi)似于A549細(xì)胞中的結(jié)果。雖然OB細(xì)胞中也有陽(yáng)性AC3呈顆粒狀紅色熒光,但AC3與初級(jí)纖毛并不存在共定位關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1、AC3基因內(nèi)源性表達(dá)于PC12、U251、IMCD3、293T、BMSCs、O