番茄紅素環(huán)化酶基因片段克隆的研究.pdf

1、本研究以番茄嫩葉為試驗(yàn)材料，提取幼嫩葉片的RNA，翻轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，克隆了番茄紅素分解兩個(gè)關(guān)鍵酶基因，即β環(huán)化酶和ε環(huán)化酶基因，并分別構(gòu)建了這兩個(gè)基因的反義表達(dá)載體，在此基礎(chǔ)上又構(gòu)建了這兩個(gè)基因反義融合的表達(dá)載體。與此同時(shí)，對(duì)該品種的番茄再生體系也進(jìn)行了優(yōu)化，為下一步轉(zhuǎn)化做好了準(zhǔn)備。目前取得的結(jié)果總結(jié)如下： 1利用尿素-Licl法提取番茄葉片中的RNA，根據(jù)Genbank登陸的番茄紅素環(huán)化酶基因，即β環(huán)化酶基因和ε環(huán)化酶基

2、因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物。提取番茄葉片的RNA，經(jīng)RT-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出723 bp和569 bp的目的片段，將它們分別連接到Peasy-T1 Cloning Vector上，測(cè)序鑒定其正確性。通過(guò)Genebank序列分析比對(duì)，克隆到的基因與番茄紅素環(huán)化酶基因同源性達(dá)到10096，由此可以看出，這兩個(gè)基因正是所需要的番茄紅素環(huán)化酶基因。 2對(duì)克隆到的兩個(gè)基因測(cè)序序列用分子生物學(xué)軟件primer5.0進(jìn)行分析酶切位點(diǎn)，篩選出合

3、適的插入方向的基因。挑取番茄紅素β環(huán)化酶基因正向插入克隆載體的基因，構(gòu)建番茄紅素β環(huán)化酶的反義表達(dá)載體pro-b；而番茄紅素ε環(huán)化酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建則是選取了反向插入克隆載體的基因，這樣酶切連接到PROK2上時(shí)正好是反向表達(dá)的，因此也構(gòu)建成功了番茄紅素ε環(huán)化酶基因pro-e。在構(gòu)建反義融合基因時(shí)，利用兩個(gè)基因的共同酶切位點(diǎn)，亞克隆成融合基因PUC-b+e，然后再將克隆到的基因與PROK2連接，構(gòu)建成了番茄紅素β環(huán)化酶和ε環(huán)化酶融合基因

4、的反義表達(dá)載體pro-b+e。 3在前人研究的基礎(chǔ)上，以番茄子葉為受體材料，研究了不同激素配比對(duì)再生芽的影響、不同激素配比對(duì)生根的影響、番茄褐化現(xiàn)象的控制等。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，再生芽以培養(yǎng)基MS+ZT1.5(mg/L)+IAA0.2(mg/L)，再生率最高；選用12d苗齡的子葉再生率最高；再生芽生根培養(yǎng)基則以1/2MS(MS)+IAA0.2(mg/L)時(shí)，生根最早，生根量最多；另外，在解決番茄褐化現(xiàn)象上，通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，檸檬酸在30m