番茄ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆及Rhodobacter sphaeroidesTC40生產(chǎn)番茄紅素的載體的構建.pdf

1、番茄紅素屬類胡蘿卜素，是目前自然界中發(fā)現(xiàn)的最強的抗氧化劑之一。隨著人類對番茄紅素藥用價值及醫(yī)療保健作用的不斷發(fā)現(xiàn)，對其產(chǎn)量的需求也變的越來越大。目前番茄紅素主要從植物中提取，不僅成本比較高，而且也難以進行規(guī)?；纳a(chǎn)，所以利用基因工程的方法定向培育出能夠在菌體內(nèi)大量積累番茄紅素的微生物，而后利用發(fā)酵罐來大規(guī)模的生產(chǎn)番茄紅素，有極大的應用價值，對滿足人們健康的需求同樣具有極大的現(xiàn)實意義。番茄紅素在番茄果實中合成途徑模式是：IPP→DMAP

2、P→GPP→FPP→GGPP→Phytone→Lycopene。八氫番茄紅素經(jīng)過連續(xù)的脫氫反應、共軛雙鍵延長，經(jīng)八氫番茄紅素脫氫酶(PDS)脫氫形成ζ-類胡蘿卜素，直至在ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS)，類胡蘿卜素異構酶(CRTISO)作用下一共進行四次脫氫反應形成番茄紅素(Lycopene)。ZDS的cDNA全長1.8～2.lkb，編碼558～574個氨基酸。ZDS和PDS基因大小相近，氨基酸同源性為29％～31％。番茄紅素是番茄果實中類

3、胡蘿卜素代謝途徑的中間產(chǎn)物，在自然界，類胡蘿卜素合成途徑廣泛存在于動物，植物及微生物中，光合細菌（Rhodobacter sphaeroides）的類胡蘿卜素代謝途徑的中間產(chǎn)物與番茄果實中番茄紅素合成途徑具有相同的前體，IPP→DMAPP→GPP→FPP→GGPP→Phytone→Neurosporene。R. sphaeroides中八氫番茄紅素脫氫酶（CrtI）催化三次脫氫反應生成鏈孢霉素。因此，明確植物及微生物Crt途徑基因的功能

4、及作用機制，為通過基因工程生產(chǎn)研究番茄紅素提供了重要前提。
　　在植物基因工程中，已用噬夏孢歐文氏菌（Erwinia uredovora）的CrtI基因替代植物中的PDS、ZDS和CRTISO這三個基因產(chǎn)生番茄紅素。E.uredovora的CrtI基因與R. sphaeroides不同，催化四次脫氫生成番茄紅素，而非R. sphaeroides的鏈孢霉素。已有研究表明E.uredovora的CrtI基因在R. sphaeroide

5、s中表達，可產(chǎn)生番茄紅素。這些研究使我們對R. sphaeroides的Crt基因調控、操作機理更加明確，為利用基因工程技術改良R. sphaeroides的Crt途徑生成番茄紅素提供了理論依據(jù)。本文通過在R. sphaeroides定點突變株TC40中表達番茄ZDS基因生產(chǎn)番茄紅素進行了以下研究。
　?、俜謩e提取普通番茄Breaker時期的果實，花，葉，莖中的總RNA。
　?、诒容^了GenBank中已登錄的多種植物的ZDS

6、基因的氨基酸序列和核苷酸序列，在NEW ENGLAND查找酶切位點，發(fā)現(xiàn)ZDS基因序列上布滿了酶切位點，表達載體 PRKR5強啟動子下游的酶在 ZDS基因上都具有酶切位點，所以不能直接利用載體強啟動子下游的酶點SacI和XbaI將ZDS基因引入表達載體。
　?、墼囼炘O計了幾個方案進行以便使目的基因ZDS能正確的接入載體進行表達。
　　④在啟動子和終止子處根據(jù)保守序列設計引物，利用RT－PCR和PCR技術從番茄果實，花，葉，中

7、，克隆出番茄ZDS基因的cDNA序列。序列分析表明，ZDScDNA全長1776 bp，該cDNA編碼一個含有589個氨基酸的膜結合蛋白，與NCBI登錄的辣椒和擬南芥ZDS的cDNA序列的同源性分別為64.7%和64.5%，與辣椒和擬南芥的氨基酸序列同源性都為79.9%。
　?、輰①|粒pMD18-T與PCR產(chǎn)物ZDS基因構建了中間載體pMD18-ZDS。
　?、迣①|粒pMD18-T與PCR產(chǎn)物WYG基因構建了中間載體pMD18

8、-WYG，用SacI，XbaI酶切pMD18-WYG，將WYG基因片段與用SacI，XbaI酶切的表達載體pRKR5連接構建中間載體pRKR5-WYG，在表達載體上引入XhoI酶切位點。
　　⑦將中間載體pMD18-ZDS用XhoI酶切得到ZDS基因片段，將ZDS基因片段連入XhoI酶切后的質粒pRKR5，構建表達載體pRKR5-ZDS。
　?、嗬媒雍限D移將載體pRKR5-ZDS重組至R. sphaeroides定點突變株