玉米源八氫番茄紅素脫氫酶的原核表達(dá).pdf

1、本論文分為兩個(gè)部分，第一部分為玉米源八氫番茄紅素脫氫酶的原核表達(dá)，第二部分為雙基因沉默RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與分析。
　　 采用植物體內(nèi)的某種酶為除草劑的靶標(biāo)，進(jìn)行高通量篩選是除草劑創(chuàng)制的重要領(lǐng)域。八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)作為除草劑領(lǐng)域的重要靶標(biāo)酶，是除草劑開發(fā)的熱點(diǎn)。本研究對(duì)PDS酶進(jìn)行了表達(dá)和純化，為基于PDS酶的高通量除草劑篩選奠定了基礎(chǔ)。
　　 保持玉米源八氫番茄紅素脫

2、氫酶的氨基酸序列不變，根據(jù)大腸桿菌偏愛(ài)密碼子反翻譯八氫番茄紅素脫氫酶的編碼基因，采用密碼子優(yōu)化原則設(shè)計(jì)合成編碼八氫番茄紅素脫氫酶的基因片段PDS。將基因片段插入到融合載體pET-30c(+)形成載體pET-PDS，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)。
　　 對(duì)重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-PDS進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，選擇IPTG終濃度及誘導(dǎo)溫度為考察因子，確定最優(yōu)表達(dá)條件為IPTG終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)溫度25℃，誘導(dǎo)培

3、養(yǎng)4 h。在最適表達(dá)條件下對(duì)重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET-PDS進(jìn)行培養(yǎng)，采用超聲波破碎法將菌體破碎，經(jīng)SP FF親和層析和SP離子交換層析，純化得到的目的蛋白。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示未經(jīng)密碼子優(yōu)化的核酸序列在大腸桿菌中的表達(dá)量較低，而人工合成的優(yōu)化了密碼子的核酸序列在預(yù)期位置即63 kDa左右處有較明顯表達(dá)帶，其表達(dá)量占大腸桿菌菌體總蛋白的27.6％。
　　 聯(lián)合幾種不同的目的基因進(jìn)行RNA干擾可能達(dá)到更好的基

4、因沉默效果，但不同表達(dá)元件之間的相互關(guān)系對(duì)干擾效果也可能有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了PolⅡ啟動(dòng)子apoA-Ⅰ啟動(dòng)子調(diào)控的靶向綠色熒光蛋白以及靶向hTERT的單基因和雙基因RNA干擾載體，通過(guò)綠色熒光蛋白在肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的表達(dá)量以及hTERT mRNA的表達(dá)量來(lái)考察基因的沉默效果。結(jié)果表明，雙基因RNAi載體的RNAi活性高于單基因RNAi載體，且不同方向組合的兩個(gè)表達(dá)元件所誘導(dǎo)的基因沉默效果沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明兩個(gè)干擾元件之