RNA干擾三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶基因的研究.pdf

1、絲狀真菌是一種重要的工業(yè)生產(chǎn)菌種，對其代謝調(diào)控的研究一直是國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。絲狀真菌三孢布拉氏霉菌（Blakeslea trispora）生長迅速，生物量高，菌體內(nèi)甲羥戊酸途徑代謝流量大，是目前唯一可以工業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的優(yōu)良菌種，但對于該菌的遺傳學(xué)研究較為滯后，有關(guān)三孢布拉氏霉菌基因功能和代謝調(diào)控的研究很少。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)是一種快速、高效、強(qiáng)有力的用于確定基因功能、調(diào)節(jié)基因表達(dá)以及了解基

2、因之間相互關(guān)系的研究工具。與傳統(tǒng)的基因敲除相比，無論是沉默基因的效率還是實驗周期，都有著無可比擬的優(yōu)勢。 本研究將RNAi技術(shù)應(yīng)用于三孢布拉氏霉菌中，建立了一套完整的適用于三孢布拉氏霉菌的RNAi技術(shù)路線和方法，探討了RNAi技術(shù)在絲狀真菌中的適用性，并加深了對番茄紅環(huán)化酶基因（carRA）功能的了解，豐富了對三孢布拉氏霉菌代謝途徑的認(rèn)識。這些結(jié)果為進(jìn)一步將RNAi技術(shù)應(yīng)用于真菌的基因工程改造提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，主要結(jié)果如

3、下： 本文首先針對三孢布拉氏霉菌carRA基因序列的CDS區(qū)設(shè)計RNAi干擾靶點(diǎn)，通過有效性篩選和同源性比對確定了3個靶點(diǎn)，設(shè)計并人工合成了三條靶向carRA基因的短發(fā)卡狀（short hairpin RNA，shRNA）序列及一條陰性對照序列，并定向克隆到小干擾RNA（Short interfering RNA，siRNA）表達(dá)載體mU6 pro上，分別命名為mU6 pro shRNA-carRAl，mU6 pro shRNA

4、-carRA2，mU6 pro shRNA-carRA3和mU6 pro shRNA-control，通過雙酶切與測序法鑒定得到的目的產(chǎn)物與預(yù)期一致。該質(zhì)粒具有操作簡單、成本低廉、靶向性好、作用時間長等優(yōu)點(diǎn)。 對三孢布拉氏霉菌的原生質(zhì)體制備及再生進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過摸索菌體培養(yǎng)時間、酶種類、酶濃度、酶解pH、酶解時間、酶解溫度、酶解方式、預(yù)處理方式等對三孢布拉氏霉菌原生質(zhì)體形成和再生的影響，確定了原生質(zhì)體制備的最佳條件：酶解體系

5、為pH6.0的0，6mol/L NaCl配制的2%溶菌酶+3%纖維素酶+3%蝸牛酶的復(fù)合酶系，酶解溫度為28℃，酶解方式采用75rpm振蕩酶解，酶解時間為14h。在此條件下得到的原生質(zhì)體制備率最高，為7.48×106原生質(zhì)體/mL。原生質(zhì)體再生結(jié)果顯示，在0.7mol/L NaCl配制的PDA再生培養(yǎng)基上，采用雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行原生質(zhì)體再生，得到的再生率較高，再生平板可作保存菌種之用。 成功建立了mRNA水平檢測三孢布拉氏霉菌中

6、RNAi效果的方法，包括RNA提取、PCR優(yōu)化、Real Time PCR定量分析。首先建立了一種簡單、有效的適合絲狀真菌的RNA提取方法一改良異硫氰酸胍法，結(jié)果表明氯化芐能與多糖反應(yīng)破壞真菌細(xì)胞壁，胞內(nèi)RNA因細(xì)胞破裂而得以釋放；乙酸鉀和低濃度乙醇共同作用可去除絕大部分的多糖，且RNA樣品完好。應(yīng)用該方法所得的RNA產(chǎn)量較高，達(dá)到110.7μg/g，且OD260/OD280=1.93，OD260/OD230=2.27，說明RNA純度符

7、合要求，進(jìn)一步通過RT-PCR和Northern blot證明此方法得到了高質(zhì)量的RNA。在此基礎(chǔ)上結(jié)合實驗設(shè)計與人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的方法優(yōu)化了擴(kuò)增體系及條件，建立了Real Time PCR技術(shù)定量分析carRA基因的方法，克服了SYBR GreenⅠ熒光染料特異性差、定量不準(zhǔn)的弊端。分析結(jié)果顯示：mU6 pro shRNA-carRAl干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，carRA基因的表達(dá)量為未干擾組的43.2%，而mU6 pro shRNA-cont

8、rol陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，carRA基因的表達(dá)量為未干擾組的98.7%。因此從mRNA水平證明了我們構(gòu)建的干擾質(zhì)粒mU6pro shRNA-carRAl對carRA基因的表達(dá)有明顯的抑制作用。 成功建立了蛋白水平檢測三孢布拉氏霉菌中RNAi效果的一套方法，包括特異性抗體制備、蛋白提取和Western blot檢測。鑒于三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶基因中含有太多稀有密碼子，不能在大腸桿菌中將抗原高表達(dá)，無法用常規(guī)方法制備抗體。

9、本文利用設(shè)計并合成抗原多肽的方法制備得到了三孢布拉氏霉菌番茄紅素環(huán)化酶專一性抗體，效價高達(dá)1：32000。比較了三種蛋白提取方法，通過對蛋白產(chǎn)量和SDS-PAGE圖譜進(jìn)行分析，確定植物試劑盒法為最適蛋白提取方法，蛋白產(chǎn)量將近4mg/g，SDS-PAGE圖譜中蛋白條帶清晰且完整。并在此基礎(chǔ)上建立了Western blot技術(shù)定量分析番茄紅素環(huán)化酶的方法，結(jié)果顯示：與未干擾組相比，mU6 pro shRNA-carRAl干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染84h后

10、，carRA蛋白表達(dá)量明顯下降，而陰性對照組沒有顯著變化，從而在蛋白水平證明了我們構(gòu)建的干擾質(zhì)粒mU6 proshRNA-carRAl對carRA表達(dá)有明顯的抑制作用。 成功建立了功能學(xué)水平檢測三孢布拉氏霉菌中RNAi效果的方法。通過對原生質(zhì)體形態(tài)及菌絲體形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)靶向carRA基因的shRNA干擾技術(shù)可以應(yīng)用在三孢布拉氏霉菌中而不產(chǎn)生細(xì)胞毒性；通過對發(fā)酵后菌體生物量的檢測說明該技術(shù)不影響細(xì)胞的存活與增殖；通過HPLC檢測發(fā)