癲癇患者發(fā)作后血清腺苷酸酶活性的動(dòng)態(tài)變化的研究.pdf

1、背景：癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的急癥、重癥之一，全球有數(shù)千萬(wàn)的癲癇病人，反復(fù)的癲癇發(fā)作給個(gè)人、家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和心理負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，癲癇的病因、發(fā)病機(jī)制、病理和治療等許多方面的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)展，但癲癇發(fā)作具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，每次癲癇發(fā)作起始與終止的內(nèi)在機(jī)制具體不清。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腺苷系統(tǒng)是腦內(nèi)重要的抗癲癇和腦保護(hù)系統(tǒng)。腺苷系統(tǒng)通過(guò)腺苷與G蛋白偶聯(lián)腺苷受體的相互作用在腦內(nèi)發(fā)揮重要的神經(jīng)抑制作用，急性癲癇發(fā)作后腺苷水平急劇增

2、高，終止發(fā)作，因此腺苷系統(tǒng)被稱(chēng)為“內(nèi)源性抗癲癇系統(tǒng)”，成為癲癇研究新的熱點(diǎn)。腺苷酸如三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)及其衍生物腺苷(adenosine，ADO)在一些生理和病理過(guò)程中都是重要的信號(hào)分子。研究證明，腺苷是一個(gè)有效的抗驚厥劑，并具有神經(jīng)保護(hù)特性。研究證實(shí)，給予

3、致驚厥藥物后，在癲癇發(fā)作問(wèn)期和發(fā)作期間大鼠海馬內(nèi)腺苷釋放明顯增加。腺苷和腺苷A1受體激動(dòng)劑能明顯地保護(hù)急性給予戊四氮的大鼠，避免癇性發(fā)作。這些都提示內(nèi)源性腺苷具有神經(jīng)保護(hù)和抗驚厥的作用。而且實(shí)驗(yàn)性癲癇發(fā)作使腦內(nèi)腺苷水平升高，在許多病理情況下，與人類(lèi)循環(huán)血漿腺苷濃度迅速升高有關(guān)。腺苷主要由腺苷酸酶水解腺苷酸而產(chǎn)生。腺苷酸酶能錨定在細(xì)胞膜上，在體液中是可溶性的。這些酶包括：⑴三磷酸腺苷二磷酸水解酶家族；⑵腺苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族；⑶5’

4、-末端核苷酸酶。人類(lèi)血清水解腺苷酸的能力依賴于循環(huán)中可溶性核苷酸酶的存在。ATP通過(guò)可溶性磷酸二酯酶作用首先地轉(zhuǎn)換成AMP和無(wú)機(jī)焦磷酸。相反ADP通過(guò)三磷酸腺苷二磷酸水解酶優(yōu)先地轉(zhuǎn)換成AMP和無(wú)機(jī)磷酸。最后AMP通過(guò)可溶性5’-核苷酸酶水解成腺苷。腺苷主要通過(guò)激活高親和力抑制性腺苷A1受體和興奮性腺苷A2受體來(lái)發(fā)揮作用。腺苷酸酶控制腺苷酸和腺苷酸受體配體的有效性。在戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作產(chǎn)生了腺苷酸水解的變化。Bonan等研究證實(shí)，在

5、匹魯卡品和紅藻氨酸點(diǎn)燃的癲癇大鼠模型的海馬和腦皮質(zhì)的突觸小體內(nèi)，ATP二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性升高。在注射戊四氮誘導(dǎo)單次驚厥的大鼠和進(jìn)行戊四氮點(diǎn)燃誘導(dǎo)癲癇發(fā)作的大鼠血清ATP、ADP和AMP水解率顯著增加，證明三磷酸腺苷二磷酸水解酶和5’-核苷酸酶活性的顯著升高，提示血清核苷酸酶途徑的刺激可能在減弱癲癇發(fā)作事件中起一定作用。目前有關(guān)癲癇患者發(fā)作后腺苷酸酶活性的動(dòng)態(tài)變化的研究甚少。目前，磷酸-硝基酚-5’-一磷酸胸苷(p-nitr

6、ophenil-5’-thymidine monophosphate，p-Nph-5'-TPM)已經(jīng)被用為磷酸二酯酶的人工底物，產(chǎn)生磷酸-硝基酚?，F(xiàn)通過(guò)測(cè)定癲癇患者血清ATP、ADP、AMP水解率和可溶性磷酸二酯酶活性的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)一步探討腺苷酸酶在癲癇發(fā)作過(guò)程中的調(diào)節(jié)機(jī)制。本研究分兩部分：
　　 第一部分：癲癇患者發(fā)作后血清ATP、ADP、AMP水解率的動(dòng)態(tài)變化。
　　 目的：研究癲癇患者發(fā)作后各時(shí)間點(diǎn)ATP、ADP和

7、AMP水解率的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義，探討ATP、ADP和AMP水解對(duì)癲癇發(fā)作過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：⑴研究對(duì)象系我院神經(jīng)內(nèi)科2008年06月至2009年10月住院的癲癇患者30例，其中男17例，女13例；年齡12～63歲，平均(30.6±11.2)歲；病程2～31年，平均病程(9±3.8)年。所有患者均行24h視頻腦電圖檢查，監(jiān)測(cè)癇性發(fā)作的臨床電生理特點(diǎn)，并行顱腦磁共振(magnetic resonance imaging

8、，MRI)檢查。所有患者依據(jù)國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟癲癇發(fā)作分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)(InternationalLeague Against Epilepsy，ILAE，1981)進(jìn)行分類(lèi)，12例患者為全面性強(qiáng)直陣攣性發(fā)作，18例患者為復(fù)雜部分性發(fā)作。排除神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性加重疾病、代謝性疾病、心血管疾病。11例患者在抗癲癇藥物單藥治療，19例患者在聯(lián)合治療中(平均應(yīng)用藥物數(shù)目2種)。(2)正常對(duì)照組：20人，均來(lái)源于我院門(mén)診健康查體者，無(wú)癲癇、神經(jīng)系統(tǒng)疾病及心血管

9、疾病。其中男11人，女9人，年齡20～50歲，平均(28.3±7.86)歲。兩組在性別、年齡方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑵標(biāo)本采集兩組于早晨抽取空腹肘靜脈血，均于抽血前1 h內(nèi)安靜臥床休息。癲癇患者于肘靜脈處置靜脈留置針。癲癇組患者抽血樣前12 h內(nèi)無(wú)癇性發(fā)作，于癇性發(fā)作后5min，10min，20min，30min，60min和10h再抽取血樣。所有血樣室溫靜置30～60 min，4℃下離心3000 r/min15 min，取上層血清置于Epp

10、endorf管，-70℃冰箱保存待測(cè)。⑶ATP、ADP、AMP水解率的測(cè)定按Bruno等報(bào)道進(jìn)行ATP、ADP、AMP水解率的測(cè)定。含有5 mmol/L CaCl2和44 mmol/L Tris-HCl溶液共175 ul，pH值調(diào)節(jié)為8.0(測(cè)定AMP水解時(shí)pH7.2)。加入5 ul血清，在37℃下預(yù)孵育10min。加入10 ul ATP或ADP或AMP，最終達(dá)到1.0mmol/L的反應(yīng)濃度，37℃下孵育10 min。加入200 ul1

11、0％三氯醋酸終止反應(yīng)。630 nm處測(cè)定吸光度。所有血樣均測(cè)定三次。酶活性用每分鐘每毫升血清釋放的無(wú)機(jī)磷酸鹽量(nmol)表示。
　　 結(jié)果：①所有患者中24例24小時(shí)視頻腦電圖檢查檢測(cè)到尖波或棘波或尖慢綜合波或棘慢綜合波或多棘慢綜合波或多棘波，6例未檢測(cè)到癲癇樣放電波。頭顱MILI檢查有13例檢出異常，包括顱內(nèi)占位、顱內(nèi)軟化灶、腦萎縮、海馬硬化等。30例病人中，3例有顱內(nèi)感染史，2例有腦血管病史，2例有顱腦外傷史，1例有腦萎縮

12、史，1例有顱腦手術(shù)史。②與正常對(duì)照組相比，癲癇組發(fā)作間期ATP、ADP和AMP的水解率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癲癇發(fā)作后ATP、ADP和AMP的水解率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。③與正常對(duì)照組相比，癲癇組發(fā)作后5 min，ATP水解率顯著升高，20 min達(dá)高峰，60 min時(shí)仍保持高水平，10 h后恢復(fù)至基線水平。④與正常對(duì)照組相比，癲癇組癲癇發(fā)作后5 min，ADP和AMP的水解率顯著升高達(dá)高峰，一直增高至30 min，6

13、0 min時(shí)ADP的水解率恢復(fù)至基線水平，而AMP水解率較正常對(duì)照組明顯下降，10 h恢復(fù)至基線水平。ADP大部分與AMP水解變化相一致。
　　 結(jié)論：⑴癲癇發(fā)作間期，ATP、ADP和AMP的水解率未見(jiàn)明顯升高。⑵癲癇患者發(fā)作后，ATP、ADP和AMP的水解率明顯升高。⑶ADP與AMP水解變化大部分相一致。⑷癲癇發(fā)作后可能存在腺苷酸酶活性升高，腺苷酸酶活性增高可能參與了癲癇發(fā)作終止的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 第二部分：癲癇患者發(fā)

14、作后血清可溶性磷酸二酯酶活性的動(dòng)態(tài)變化。
　　 目的：研究癲癇患者發(fā)作后各時(shí)間點(diǎn)可溶性磷酸二酯酶活性的動(dòng)態(tài)變化及其臨床意義，探討腺苷酸酶對(duì)癲癇發(fā)作過(guò)程的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法：⑴選擇癲癇患者30例和正常對(duì)照者20人，12例患者為全面性強(qiáng)直陣攣性發(fā)作，18例患者為復(fù)雜部分性發(fā)作。⑵兩組于早晨抽取空腹肘靜脈血，癲癇組于癲癇發(fā)作后5 min、10 min、20min、30 min、60 min和10 h抽取肘靜脈血，取血清，-

15、70℃冰箱保存待測(cè)。⑶.磷酸二酯酶活性測(cè)定按Bruno等報(bào)道進(jìn)行磷酸二酯酶活性測(cè)定。含有0.5 mmol/L p-Nph-5'-TPM和40 mmol/L Tris-HCL溶液共230 ul，調(diào)節(jié)pH值至8.9。37℃預(yù)孵育10 min。加入20 ul血清開(kāi)始反應(yīng)，37℃孵育10 min。加入750ul0.2 mol/L NaOH終止反應(yīng)。在400 nm吸光度處測(cè)定磷酸.硝基酚的量。酶活性用每分鐘每毫升血清釋放的磷酸.硝基酚量(nmol

16、)表示。⑷應(yīng)用OLYMPUS AU600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)癲癇組和正常對(duì)照組血清樣本中LDH活性。
　　 結(jié)果：①與正常對(duì)照組相比，癲癇組發(fā)作間期血清可溶性磷酸二酯酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，癲癇發(fā)作后較對(duì)照組諸項(xiàng)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。②與正常對(duì)照組相比，癲癇組發(fā)作后5 min，血清可溶性磷酸二酯酶活性顯著升高，20 min達(dá)高峰，60 min時(shí)仍保持高水平，10 h后恢復(fù)至基線水平；癲癇發(fā)作后磷酸二酯酶活性