球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶超表達及雙價轉(zhuǎn)基因工程菌株的構(gòu)建及毒力評價.pdf

1、球孢白僵菌是最常見的蟲生真菌之一，其寄主范圍廣，易大量生產(chǎn)，已開發(fā)為真菌殺蟲劑在害蟲生物防治中廣泛應用。然而，球孢白僵菌和其它蟲生真菌一樣，具有殺蟲慢的重大缺陷。為此人們一直在潛心研究蟲生真菌的分子致病機制，以尋找可通過基因工程手段進行改造的基因。幾丁質(zhì)酶在蟲生真菌穿透寄主體壁的過程中起一定作用，但其與真菌毒力的關系尚不清楚。本研究將外源的球孢白僵菌幾丁質(zhì)酶基因Bbchit1分別轉(zhuǎn)入兩個出發(fā)菌株：含有該基因的球孢白僵菌野生型菌株RCEF

2、0013，以及將北非蝎（Androctonus australis）昆蟲特異性神經(jīng)毒素多肽基因AaIT轉(zhuǎn)入RCEF0013后獲得的一價轉(zhuǎn)基因工程菌株RCEF0013-A，從而構(gòu)建成一個雙拷貝的幾丁質(zhì)酶超表達轉(zhuǎn)基因工程菌株和一個蝎毒-幾丁質(zhì)酶雙價轉(zhuǎn)基因工程菌株。
　　 本實驗首先構(gòu)建了含有篩選標記bar基因和外源幾丁質(zhì)酶基因Bbchit1的載體pbar-GPE1-Bbchit1,通過芽生孢子法將載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入該野生型出發(fā)株RCEF0

3、013，在加入草胺磷（100μg/ml）[1]的SDAY培養(yǎng)基上篩選獲得轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建成一個雙拷貝的工程菌株RCEF0013-C。再以pbarGPE1-Bbchit1質(zhì)粒為中間載體，擴增出含有強啟動子、終止子及Bbchit1基因的GpdA-Bbchit1-TrpC基因片段，將GpdA-Bbchit1-TrpC基因片段插入pbenGPS3質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個含有篩選標記ben基因和Bbchit1基因的新質(zhì)粒pbenGPS3-Bbchit1。將

4、pben GPS3-Bbchit1質(zhì)粒用芽生孢子法轉(zhuǎn)入含有外源蝎毒基因AaITd的一價轉(zhuǎn)基因工程菌株RCEF0013-A中，在加入苯菌靈（2μg/ml）[1]的SDAY培養(yǎng)基上篩選獲得轉(zhuǎn)化子，構(gòu)建成一個雙價的轉(zhuǎn)基因工程菌株RCEF0013-A-C。幾丁質(zhì)酶酶活測定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子菌株RCEF0013-C在膠體幾丁質(zhì)誘導培養(yǎng)基中酶活最大值高于野生型菌株的4.2倍，從而使該幾丁質(zhì)酶基因在轉(zhuǎn)化的菌株中得到超表達。
　　 對馬尾松毛蟲（

5、Dendrolimus punctatus）進行生物測定的結(jié)果顯示，超量表達雙拷貝的Bbchit1轉(zhuǎn)基因及AaIT和Bbchit1雙價轉(zhuǎn)基因均能顯著地提高重組菌株的毒力。對馬尾松毛蟲幼蟲進行生物測定的結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子RCEF0013-C（4.53×105conidia/ml）的致死中濃度比出發(fā)株RCEF0013（2.93×106 conidia/ml）降低5.46倍。致死中量（17.6conidia/m㎡）比出發(fā)株（113.9 coni

6、dia/m㎡）減少5.47倍，致死中時（5.86天）比出發(fā)株（6.58天）縮短0.7天。這表明，幾丁質(zhì)酶基因超表達的球孢白僵菌雙拷貝的工程株的毒力有了顯著的提高。轉(zhuǎn)化子RCEF0013-A-C（1.60×105conidia/ml）的致死中濃度比出發(fā)株RCEF0013（2.93×106conidia/ml）降低17.31倍。致死中量（6.54conidia/mg）比出發(fā)株（113.9 conidia/mg）減少16.41倍，致死中時（4