幾丁酶-蛋白酶融合基因的構(gòu)建與球孢白僵菌毒力的提高.pdf

1、昆蟲病原真菌是一類重要的生防真菌，在農(nóng)林害蟲的防治上起著重要的作用。它主要通過機(jī)械壓力和水解酶的作用來穿透昆蟲體壁，Pr1類蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在其中起著重要作用。前人的研究表明，超量表達(dá)蛋白酶或幾丁酶基因可以提高重組菌株的毒力，但目前對(duì)于二者在穿透昆蟲體壁時(shí)是否存在協(xié)同作用還不清楚。 為了研究蛋白酶和幾丁酶在昆蟲病原真菌穿透寄主體壁時(shí)的相互作用，本文首先用掃描電鏡觀察了被蛋白酶CDEP-1、幾丁酶Bbchit1及二者混合酶液處理過

2、的桃蚜體壁，結(jié)果表明，蛋白酶與幾丁酶混合液分解寄主體壁的能力更強(qiáng)。 進(jìn)而將球孢白僵菌Pr1類蛋白酶基因CDEP-1分別與幾丁酶基因Bbchit1和Machit1融合，分生孢子電擊轉(zhuǎn)化法將融合基因?qū)肭蜴甙捉┚小orthernblotting和Westernblotting結(jié)果證明，這些基因均在重組菌株中組成性轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。 生物測(cè)定結(jié)果表明，超量表達(dá)CDEP-1、Bbchit1單價(jià)基因及二者融合基因CDEP-1∷Bbc

3、hit1均能提高重組菌株對(duì)桃蚜的毒力，且融合基因重組菌株的毒力提高幅度更大。在孢子濃度為1×107個(gè)/ml時(shí)，與野生型菌株Bb0062-15相比，超量表達(dá)蛋白酶CDEP-1基因重組菌株的致死中時(shí)(LT50)平均縮短了8.84﹪；超量表達(dá)幾丁酶Bbchit1基因重組菌株的LT50平均縮短了9.92﹪；而融合基因CDEP-1∷Bbchit1重組菌株的LT50平均縮短了21.12﹪。接種108h及120h后，融合基因CDEP-1∷Bbchit

4、1重組菌株CDEP-1∷Bbchit1-41的致死中濃度(LC50)分別降低了67.42﹪和60.50﹪，下降幅度分別為CDEP-1-6和Bbchit1-26LC50之和的2.22(108h)和1.65倍(120h)。表明超量表達(dá)融合基因CDEP-1∷Bbchit1能協(xié)同提高球孢白僵菌對(duì)寄主的毒力。 生物測(cè)定結(jié)果還表明，單獨(dú)超量表達(dá)綠僵菌幾丁酶Machit1基因不能提高重組菌株的毒力，但超量表達(dá)融合基因CDEP-1∷Machit

5、1的重組菌株卻能顯著提高球孢白僵菌的毒力。在孢子濃度為1×107個(gè)/mL時(shí)，超量表達(dá)融合基因CDEP-1∷Machit1重組菌株的LT50平均縮短了18.07﹪；在108h及120h時(shí)，CDEP-1∷Machit1-37的LC50分別比野生型菌株縮短了38.89﹪(108h)和41.68﹪(120h)，均低于相應(yīng)濃度及時(shí)間下蛋白酶基因CDEP-1重組菌株的LT50及LC50。 上述結(jié)果表明，昆蟲病原真菌的蛋白酶和幾丁質(zhì)酶在分解昆