Hog1類Bbhog1的基因敲除對球孢白僵菌毒力和抗逆性的影響.pdf

1、昆蟲病原真菌是一類重要的殺蟲微生物，在害蟲生物防治中具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前有關(guān)昆蟲病原真菌侵染致病的分子機(jī)理研究尚缺乏明晰的認(rèn)識(shí)，限制了真菌殺蟲劑的開發(fā)利用。MAPK是一類廣泛存在于真核生物的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。MAPK級聯(lián)反應(yīng)逐級磷酸化將胞外信號放大并傳遞。微生物能夠通過該級聯(lián)反應(yīng)對外界信號的誘導(dǎo)作出相應(yīng)的反應(yīng)。近年來的研究表明，MAPK胞外信號傳導(dǎo)途徑與植物和人類病原真菌的發(fā)育、分化及致病性密切相關(guān)，成為研

2、究病原真菌發(fā)育分化及侵染致病分子機(jī)理的重要對象。但MAPK信號途徑在昆蟲病原真菌的毒力和抗逆性有何影響?目前尚無報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)室從昆蟲病原真菌球孢白僵菌(Beauveriabassiana)中克隆了與酵母HOG1類MAPK同源的基因Bbhog1。為了弄清該基因的功能，本文利用同源重組的方法敲除球孢白僵菌Bbhog1基因，并分析了Bbhog1的缺失對菌株的抗逆能力和毒力的影響，為研究昆蟲病原真菌發(fā)育分化與侵染致病中MAPK信號傳導(dǎo)

3、途徑奠定了基礎(chǔ)。 主要結(jié)果如下：1.利用同源重組方法獲得了4個(gè)敲除Bbhog1基因的球孢白僵菌缺失突變體，分別命名為△Bbhog1255、△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484。Southern雜交驗(yàn)證表明：外源片段以單拷貝整合到基因組中，4個(gè)突變體均無隨機(jī)插入突變；球孢白僵菌基因組中的Bbhog1基因(2.3kb)被含有破壞的該基因序列和標(biāo)記基因的約6kb片段成功置換。 2.表型分析表明：

4、 ①在0.4MNaCl滲透條件下，敲除Bbhog1基因的缺失突變體的孢子萌發(fā)和菌絲生長受到明顯抑制；在0.8MNaCl滲透條件下，完全抑制其菌絲生長。而野生型菌株和空載(pk2-bar：：GFP)轉(zhuǎn)化子在上述條件下，雖然生長速度受到一定影響，但仍可以萌發(fā)和生長。說明敲除Bbhog1的缺失突變體對高滲透壓敏感性增加。 ②在亞高溫條件(32℃)下，敲除Bbhog1基因的缺失突變體孢子幾乎不萌發(fā)。但是將生長正常的菌絲打孔接種到新鮮

5、的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與野生型菌株和pk2-bar：：GFP空載轉(zhuǎn)化子沒有明顯差別。由此可見，亞高溫逆境條件下，Bbhog1基因的缺失突變體的孢子萌發(fā)明顯受到抑制。 ③紫外照射處理表明，敲除Bbhog1基因的缺失突變體的孢子萌發(fā)率顯著降低，突變體△Bbhog1255，△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbhog1484菌株在24hr孢子萌發(fā)率分別比野生菌株降低了27.42﹪、63.86﹪、36.45﹪和27.11﹪。而

6、空載(pk2-bar：：GFP)轉(zhuǎn)化子經(jīng)紫外照射后的萌發(fā)率與野生菌株沒有明顯差異。可見Bbhog1基因與球孢白僵菌對紫外輻射抗性的調(diào)節(jié)也相關(guān)。 上述結(jié)果表明，Bbhog1基因與球孢白僵菌對滲透壓、溫度和紫外輻射等環(huán)境脅迫因子的抗性密切相關(guān)。 3.生物測定的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bbhog1基因與球孢白僵菌的毒力密切相關(guān)。在107個(gè)/mL分生孢子濃度下，突變體△Bbhog1255、△Bbhog1456、△Bbhog1461和△Bbho

7、g1484菌株對桃蚜的半致死時(shí)間(LT50)明顯延長，達(dá)236hr、228hr、185hr和283hr，分別是野生菌株的LT50137hr的1.7、1.7、1.3和2.1倍。而空載(pk2-bar：：GFP)轉(zhuǎn)化子與野生菌株相比，半致死時(shí)間沒有明顯差異。Bbhog1基因敲除使菌株對桃蚜的毒力顯著降低。 上述結(jié)果表明，敲除Bbhog1基因?qū)е虑蜴甙捉┚亩玖ο陆?，對高滲、亞高溫和紫外線的抗性降低；推測Bbhog1基因與球孢白僵菌毒