醬油添加酵母耐鹽基因HOG1的研究.pdf

1、醬油中的主要風(fēng)味物質(zhì)大都是由發(fā)酵過程中添加的酵母產(chǎn)生，但是在醬油高鹽稀態(tài)發(fā)酵中鹽的濃度高達(dá)17％，致使酵母的代謝活性明顯降低，這嚴(yán)重影響風(fēng)味物質(zhì)的形成，導(dǎo)致醬油質(zhì)量下降。因此，本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用基因組重排技術(shù)，以野生型T酵母為出發(fā)菌株構(gòu)建了耐鹽的優(yōu)良酵母菌株T3-5。此外，因?yàn)槟壳皩酵母的基因組序列處于未知狀態(tài)，而且對于T酵母和T3-5耐鹽機(jī)制還不清楚。所以本文對T酵母(Torulopsisversatilis)和T3-5的耐鹽基因HOG1

2、進(jìn)行研究，即在基因轉(zhuǎn)錄水平、基因的過量表達(dá)、DNA序列及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等分子水平上進(jìn)行多角度的分析及比對，從而為闡明T酵母的耐鹽機(jī)制奠定良好基礎(chǔ)。
　　 本文通過半定量PCR(RT-PCR)對T酵母和T3-5在不同鹽濃度下耐鹽基因HOG1的RNA表達(dá)量進(jìn)行了分析，研究發(fā)現(xiàn)，T3-5的HOG1表達(dá)量明顯高于T酵母;繼而對T酵母和T3-5的HOG1進(jìn)行克隆測序，即分別將其PCR產(chǎn)物插入到測序載體pUC19中，構(gòu)建質(zhì)粒pUC19-T和pU

3、C19-T5，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)T3-5的HOG1的堿基發(fā)生了突變;而后將測序結(jié)果翻譯成氨基酸，并經(jīng)NCBI比對，整理拼接后進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，分析發(fā)現(xiàn)T和T3-5之間有兩個(gè)明顯的氨基酸差異，同時(shí)T3-5的蛋白等電點(diǎn)高于T酵母;最后，分別將T酵母和T3-5的HOG1目的基因片段插入到Y(jié)Ep195表達(dá)載體中，隨后將所構(gòu)建的質(zhì)粒YEp195-T和YEp195-T3-5分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母實(shí)驗(yàn)室菌株W303-1A中，并對所構(gòu)建的工程菌株進(jìn)行