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文檔簡介
1、本文參考前人在林木組織培養(yǎng)工作成果和美國楓香組織培養(yǎng)體系,對影響中國楓香培養(yǎng)體系的各種因子進(jìn)行系統(tǒng)分析,建立了中國楓香愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)以及生根誘導(dǎo)和移栽的技術(shù)體系,為中國楓香分子育種奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)1/2MS基本培養(yǎng)基是比較適合于中國楓香的基本培養(yǎng)基,經(jīng)過優(yōu)化的組織培養(yǎng)參數(shù)為:以下胚軸為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體;以添加3.0mg.L-16-BA和0.5mg.L-1NAA的1/2MS基本培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基;添加6-B
2、A1.0mg.L-1和NAA0.1mg.L-1的1/2MS基本培養(yǎng)基為不定芽分化培養(yǎng)基。中國楓香生根比較容易,在WPM基本培養(yǎng)基中添加2.0mg.L-1的IBA,培養(yǎng)兩周后即可生根,中國楓香移栽也比較容易,但移栽后水肥管理要求相對嚴(yán)格,移栽成活率可達(dá)95%以上。 中國楓香對卡那霉素比較敏感,培養(yǎng)基中添加25mg.L-1的卡那霉素培養(yǎng)2w后外植體全部死亡。5×濃度的農(nóng)桿菌比較適宜于中國楓香轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化效率相對較高,且共培養(yǎng)期間和選擇
3、培養(yǎng)期間農(nóng)桿菌生長可以得到有效抑制。 為了避免組成型啟動(dòng)子對轉(zhuǎn)基因植株生長發(fā)育的影響以及對轉(zhuǎn)基因植株光合產(chǎn)物的浪費(fèi),根據(jù)GENBANK上公布的序列,我們設(shè)計(jì)引物從擬南芥(Colombia生態(tài)型)中克隆了控制植物對干旱、低溫和鹽堿脅迫反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A基因,該基因全長891bp,含有2個(gè)DRE反式作用元件。利用該啟動(dòng)子以及中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的pBin438質(zhì)粒,構(gòu)建了由該啟動(dòng)子引導(dǎo)的含有Ω翻譯增強(qiáng)
4、子和MCS葉綠體小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽(由臺灣中央研究員植物研究所胡秀敏博士贈送)的新型質(zhì)粒pBinRd29A,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,獲得了轉(zhuǎn)基因中國楓香陽性植株17株,耐鹽轉(zhuǎn)基因煙草陽性植株28株,其中轉(zhuǎn)基因煙草能夠正常生長發(fā)育,開花,已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)基因植株的T1代種子。對轉(zhuǎn)基因植株中外源基因檢測結(jié)果表明,外源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因陽性植株基因組中。對轉(zhuǎn)基因煙草T1代種子進(jìn)行卡那霉素抗性檢測,外源基因的遺傳符合3:1分離比假設(shè),說明了轉(zhuǎn)基因植株
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