曲霉耐鹽突變體耐鹽相關(guān)基因的發(fā)掘研究.pdf

1、曲霉耐鹽突變體CCHA(AspergillusglaucusCCHA)菌株是由吉林大學(xué)張世宏實(shí)驗(yàn)室從曬鹽場(chǎng)鹽池周邊分離篩選的1株極端耐鹽真菌，前期研究證明該菌具有較強(qiáng)的耐鹽性，為了挖掘其耐鹽相關(guān)基因，探索其耐鹽的分子機(jī)制，本研究在對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建鹽脅迫后曲霉突變體的cDNA文庫(kù)，并進(jìn)行耐鹽基因的篩選，對(duì)篩選得到的高耐鹽克隆進(jìn)行了測(cè)序、生物信息學(xué)分析及初步的耐鹽性鑒定。本研究為闡明曲霉突變體的耐鹽機(jī)制

2、、挖掘耐鹽相關(guān)基因及林木耐鹽轉(zhuǎn)基因育種提供物質(zhì)（基因）基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 Solaxa高通量全基因組測(cè)序結(jié)果表明，曲霉耐鹽突變體基因組大小約為28.9Mb，有效長(zhǎng)度大于1kb的contigs有313個(gè)，有效長(zhǎng)度大于1kb的scaffolds有105個(gè)，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到10066個(gè)unigenes。
　　 曲霉耐鹽突變體CCHA在含有170g·L-1NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)一周后提取RNA，構(gòu)建鹽脅迫后曲霉耐鹽

3、突變體的cDNA文庫(kù)。原始文庫(kù)滴度為4.8×106pfu·mL-1，重組率約為90％，插入片段集中在500-1500bp范圍內(nèi)，平均長(zhǎng)度大于750bp。對(duì)隨機(jī)挑選的130個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，獲得了100條有效序列，利用NCBI的blastx進(jìn)行比對(duì)結(jié)果表明82條序列有相應(yīng)的同源序列和相關(guān)注釋信息，它們分別與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、滲透物合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)。
　　 提取文庫(kù)的混合質(zhì)粒DNA，電激轉(zhuǎn)化E.coliBL21Star(DE3)，文庫(kù)滴度

4、為1.6×104pfu·mL-1，在含有不同濃度的NaCl培養(yǎng)基中進(jìn)行耐鹽克隆篩選，共得到60個(gè)耐鹽克隆可以耐受0.7mol·L-1NaCl，其中有5個(gè)可以耐受1MNaCl，針對(duì)這5個(gè)高耐鹽克隆插入序列進(jìn)行了測(cè)序和blastx分析，其中CCHA-2229屬于COGO428基因家族成員（質(zhì)膜低鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），CCHA-2247屬于60s核糖體蛋白L27e基因家族成員。通過(guò)點(diǎn)板試驗(yàn)和生長(zhǎng)反應(yīng)曲線(xiàn)測(cè)定試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1mol·L-1NaCl鹽脅

5、迫條件下含有這5個(gè)插入片段的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌生長(zhǎng)情況均好于僅轉(zhuǎn)化空載的大腸桿菌，可以初步確定外源基因提高了大腸桿菌的耐鹽性，不同鹽脅迫處理時(shí)間下5個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化進(jìn)一步說(shuō)明這些基因與曲霉耐鹽突變體CCHA的耐鹽性密切相關(guān)。
　　 另外選擇了其中兩個(gè)耐鹽新基因，將其插入片段構(gòu)建到改造過(guò)的植物超表達(dá)載體pBI121G中，通過(guò)浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥中，分析鹽脅迫條件下的擬南芥表型試驗(yàn)可以觀察到，當(dāng)十天大小的幼苗轉(zhuǎn)移至150mMNaCl的