轉(zhuǎn)基因聚合提高煙草耐鹽性的研究.pdf

1、鹽脅迫是自然界中主要的非生物脅迫之一，目前已經(jīng)嚴重影響到世界范圍內(nèi)許多重要作物的產(chǎn)量。利用基因工程技術(shù)提高作物耐鹽性是解決這一問題的最有效途徑之一。目前，通過向植物中轉(zhuǎn)入耐鹽相關(guān)基因可在一定程度上改善植物的耐鹽性。然而，由于植物的耐鹽性是受多基因控制的復雜遺傳性狀，依賴于多個基因之間的相互作用，是多種耐鹽生理性狀的綜合體現(xiàn)，因此，轉(zhuǎn)入單個耐鹽相關(guān)基因只能部分提高植物的耐鹽性。一般認為，將多個耐鹽相關(guān)基因聚合到同一植物中有可能會大大提高轉(zhuǎn)

2、基因植物抵抗鹽脅迫的能力。 來源于大腸桿菌的betA基因，編碼膽堿脫氫酶，轉(zhuǎn)入植物后可提高細胞甘氨酸甜菜堿含量；來自于鹽芥的TsVP基因編碼V-H+-PPase，該基因過表達可提高液泡膜逆濃度梯度轉(zhuǎn)運離子的能力；AtNHXl基因編碼擬南芥液泡膜Na+/H+反向轉(zhuǎn)運蛋白，該蛋白可將胞質(zhì)中過高的Na+轉(zhuǎn)運到液泡內(nèi)積累。已有的基因工程研究表明，分別過量表達這三個單基因都可以明顯改善植物的耐鹽性。 本工作以分別轉(zhuǎn)beta基因煙草

3、(BL)、轉(zhuǎn)TsVP基因煙草(TL)和轉(zhuǎn)AtNHXl基因煙草(AL)為材料，通過有性雜交方法獲得聚合有2個不同轉(zhuǎn)基因的煙草植株，即betA×TsVP(BT)、betA×AtNHXl(BA)。PCR、Southern blot、RT-PCR和檢測甘氨酸甜菜堿含量、V-H+-PPase水解活性及Na+含量的測定結(jié)果都表明，兩個轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定存在于轉(zhuǎn)基因聚合的煙草植株中，并進行了活躍表達。通過對轉(zhuǎn)單基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株在植株和細胞水平上的一系

4、列耐鹽性分析，確定了細胞水平與植株水平的耐鹽性存在一致性，轉(zhuǎn)基因聚合植株與轉(zhuǎn)單基因植株相比具有較高的耐鹽性，但未表現(xiàn)出耐鹽程度大幅度提高。主要結(jié)果和結(jié)論如下：轉(zhuǎn)基因聚合煙草BT(betA×TsVP)的耐鹽性分析在加有相同濃度NaCl的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因聚合株系(BT)表現(xiàn)出相對較高的種子萌發(fā)率和較好的小苗長勢，植株單株鮮重最大；而轉(zhuǎn)單基因株系(分別轉(zhuǎn)betA基因和TsVP基因)次之，未轉(zhuǎn)基因?qū)φ兆畈?。表明轉(zhuǎn)基因聚合相比轉(zhuǎn)單基因提高了煙草在

5、種子萌發(fā)階段及小苗生長階段的耐鹽性。在正常的生長條件下，轉(zhuǎn)betA基因植株與未轉(zhuǎn)基因植株的生物量相似；250mM NaCl脅迫處理14天后，轉(zhuǎn)betA基因植株的生物量高于未轉(zhuǎn)基因植株。而無論在正常生長條件下還是鹽脅迫處理后，轉(zhuǎn)TsVP基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株都比未轉(zhuǎn)基因植株生長快，具有旺盛的地上部分和發(fā)達的根系，其中轉(zhuǎn)基因聚合植株的生物量最高。在正常生長條件下，轉(zhuǎn)TsVP基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株的凈光合速率顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)bet

6、A基因植株的，而TsVP轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因聚合植株之間以及未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)betA基因植株之間在光合能力上沒有顯著差異。250 mM NaCl的脅迫處理導致所有株系植株的光合活性下降，但轉(zhuǎn)基因植株的凈光合速率和Fv/Fm都比未轉(zhuǎn)基因植株的高，表明轉(zhuǎn)基因植株的光合效率較高。其它光合作用參數(shù)的測定結(jié)果也表明轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件下比未轉(zhuǎn)基因植株具有更好的光合能力，但轉(zhuǎn)基因聚合植株與轉(zhuǎn)單基因植株相比差異不大。 在鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植

7、株和未轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)Na+和Cl-含量都有所增加，但含有TsVP基因的煙草植株中積累了更多的Na+和Cl-，Na+和Cl-含量顯著高于未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)betA基因植株的。轉(zhuǎn)基因聚合植株與轉(zhuǎn)乃VP基因植株相比Na+和Cl-含量差異不顯著。利用激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合Sodium Green熒光指示劑對液泡中Na+的積累進行檢測，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫導致所有株系的細胞中熒光強度明顯升高，意味著Na+的積累量增加。轉(zhuǎn)TsVP基因細胞和轉(zhuǎn)基因聚合細胞液

8、泡中的Na+積累量顯著高于未轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏暮娃D(zhuǎn)betA基因細胞的，而轉(zhuǎn)基因聚合細胞與轉(zhuǎn)TsVP基因細胞相比，熒光強度無顯著差異，說明二者的Na+含量相似。這與鹽脅迫后植株葉片中Na+含量的測定結(jié)果是相一致的，表明TsVP的表達增加了轉(zhuǎn)基因細胞中Na+在液泡內(nèi)的積累量。 鹽分脅迫使膜系統(tǒng)受到傷害，導致不同株系植株的葉片MDA含量和細胞電解質(zhì)外滲率大幅度升高。未轉(zhuǎn)基因植株的MDA含量和細胞電解質(zhì)外滲值最大，而轉(zhuǎn)基因聚合植株的最小，并且

9、與轉(zhuǎn)單基因植株間存在不同程度的差異，表明未轉(zhuǎn)基因植株細胞受到的傷害最重，而轉(zhuǎn)基因聚合細胞受害程度最小。在細胞學水平上對鹽脅迫下細胞活力和線粒體膜完整性的測定結(jié)果得出同樣的結(jié)論，即在相同的脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因株系受害程度低，原生質(zhì)體活力高和線粒體膜完整性好。利用pH敏感的熒光探針BCECF-AM結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測了鹽脅迫對葉肉細胞質(zhì)和液泡pH值的影響。在相同濃度的NaCl脅迫下，轉(zhuǎn)基因細胞，尤其是TsVP基因過表達的細胞，pH

10、變化幅度較小，說明其能夠更好的維持細胞內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。根據(jù)能斯特方程計算跨液泡膜的質(zhì)子電勢(△ψ(H+))。在脅迫前和脅迫后，轉(zhuǎn)TsVP基因細胞和轉(zhuǎn)基因聚合細胞中的△ψ(H+)值都要顯著高于未轉(zhuǎn)基因的和轉(zhuǎn)betA基因細胞的。表明在含有外源TsVP基因的細胞中，V-H+-PPase通過水解PPi來酸化液泡，從而維持了細胞中高的跨液泡膜質(zhì)子電勢。高的跨液泡膜電勢能夠促進Na+在液泡中的區(qū)隔化，這與Na+在液泡中積累增加的實驗結(jié)果相一致。

11、 轉(zhuǎn)基因聚合煙草BA(betA×AtNHXl)的耐鹽性分析在含有相同鹽濃度的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)率和小苗生長狀態(tài)優(yōu)于未轉(zhuǎn)基因植株的。在相同的鹽濃度下，轉(zhuǎn)基因聚合煙草種子(BA)的萌發(fā)率最高，其單株鮮重略高于轉(zhuǎn)單基因植株的(分別轉(zhuǎn)betA基因和AtNHXl基因)，但差異達不到顯著水平。表明在種子萌發(fā)和幼苗生長階段轉(zhuǎn)基因聚合株系的耐鹽性略高于轉(zhuǎn)單基因株系的。 鹽脅迫增加了所有植株中的Na+含量，含有AtNHXl基因的

12、植株葉片中的Na+含量顯著高于未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)beta基因植株的。Sodium Green標記顯示，在鹽脅迫條件下液泡內(nèi)Na+積累量在轉(zhuǎn)AtNHXl基因的煙草細胞中顯著高于未轉(zhuǎn)基因細胞和轉(zhuǎn)betA基因細胞的，而轉(zhuǎn)基因聚合細胞與轉(zhuǎn)AtNHXl基因細胞在液泡內(nèi)Na+積累量上差異不顯著。這與葉片Na+含量的測定結(jié)果是相一致的，表明在含有AtNHXl基因的細胞中，AtNHXl基因的表達加速了Na+在液泡中的積累。對胞質(zhì)和液泡pH值及跨液泡膜電勢

13、的計算結(jié)果也表明轉(zhuǎn)基因細胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的能力要高于未轉(zhuǎn)基因細胞的。轉(zhuǎn)基因細胞在鹽脅迫條件下表現(xiàn)出較高活力和較好的線粒體膜的完整性，但轉(zhuǎn)基因聚合細胞和轉(zhuǎn)單基因細胞間差異不顯著。鹽處理使植株葉片的丙二醛含量和離子滲漏率都有所上升，但轉(zhuǎn)基因植株的測定值顯著低于未轉(zhuǎn)基因植株。這些結(jié)果表明在鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因細胞與未轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾染哂忻黠@提高的抗逆性，但betA×AtNHXl植株與轉(zhuǎn)單基因植株相比耐鹽性提高幅度不大。盡管在轉(zhuǎn)基因聚合植株中，各外源基

14、因分別通過各自的方式對提高植株的耐鹽性做出了貢獻，但轉(zhuǎn)基因聚合植株的耐鹽性與轉(zhuǎn)單基因植株相比提高幅度有限。雖然轉(zhuǎn)基因聚合在一定程度上改善了轉(zhuǎn)單基因植株的耐鹽性，但與單基因分別提高植株耐鹽程度之和相差很大，有可能植物的耐鹽性是多個代謝活動的綜合反應，而某些制約環(huán)節(jié)決定植株對鹽脅迫的敏感性。因此，盡管將控制不同代謝途徑的耐鹽相關(guān)基因聚合是提高植物耐鹽性的重要途徑，但深入了解與不同植株耐鹽性相關(guān)的代謝活動及其調(diào)控機制十分必要，從而擬訂出針對性