轉蠟樣芽孢桿菌acdS基因改善煙草耐鹽性研究.pdf

1、煙草是我國重要的經濟作物，土地鹽堿化引起的土壤板結、利用率低等問題一直制約著煙草在鹽堿地上的種植。植物受逆境脅迫時，乙稀含量升高且過量的乙稀會抑制植物生長并對植物造成損害。ACC氧化酶(ACO)能氧化ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylate)從而生成乙稀，而acdS基因編碼的ACC脫氨酶(ACD)能通過水解 ACC，降低植物體內乙稀的合成，有效緩解高濃度乙稀對植物生長的抑制作用，促進植物生長。實驗室前期

2、研究結果顯示海濱錦葵內生細菌蠟樣芽孢桿菌HK012(Bacillus cereusHK012)，具有較高ACC脫氨酶活性，接種于小麥等作物根系后，能顯著增強這些植物在高鹽脅迫下的抗性?；谏鲜鲅芯拷Y果，本文采用葉盤法將蠟樣芽孢桿菌HK012的acdS基因轉入煙草，獲得基因工程耐鹽煙草新品種，為提高煙草對鹽堿地的利用率提供理論基礎和技術支持。
　　論文從蠟樣芽孢桿菌HK012中克隆acdS基因，利用Gateway技術構建植物pMDC

3、45-acdS(2×35S-GFP-acdS-Nos)表達載體，并通過葉盤法將其轉入煙草中，根據(jù)重組質粒攜帶的篩選標記基因Hyg，用潮霉素濃度為15 mg/L的愈傷培養(yǎng)基(MS+1 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA+500 mg/L Cefotaxime)進行煙草不定芽的篩選，潮霉素濃度為10 mg/L的生根培養(yǎng)基(MS+250 mg/L Cefotaxime)進一步篩選轉基因苗，獲得轉基因株。通過 DNA水平、mRAN水平以

4、及蛋白質表達水平(Western blot)檢驗，表明acdS融合基因在煙草中獲得穩(wěn)定表達，熒光顯微鏡觀測顯示融合蛋白定位于煙草根系的細胞膜(或細胞壁)上。
　　對轉基因煙草 T2代幼苗進行耐鹽性檢測，實驗結果表明轉基因煙草株高、根長、干重、鮮重、葉綠素含量均大于未轉化煙草。脯氨酸含量測定結果顯示，150mM NaCl、300mM NaCl濃度下轉基因煙草葉片中脯氨酸含量相對于未轉化煙草分別提高55.15％、42.70%。保護酶(

5、SOD、POD、CAT)活性測定結果顯示，當NaCl濃度為150 mM時，轉基因煙草SOD、POD、CAT活性相對于未轉化煙草分別提高28.87%、21.57%、21.84%；當NaCl濃度為300 mM時，轉基因煙草SOD、POD、CAT活性相對于未轉化煙草分別提高31.83%、32.24%、26.30%。ACC脫氨酶活性測定結果顯示，轉基因煙草ACC脫氨酶活性均大于未轉化煙草，在150mM NaCl、300mM NaCl濃度下轉基因