釀酒酵母耐鹽基因HAL1的功能驗(yàn)證.pdf

1、耐鹽基因工程育種的一個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)是分離耐鹽相關(guān)基因,進(jìn)行基因功能驗(yàn)證,為基因工程育種提供優(yōu)良的基因資源.該研究利用從釀酒酵母菌株AS2.3 75中克隆出來(lái)的HAL1基因構(gòu)建成的植物表達(dá)載體pAHF,通過(guò)三親雜交轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中.用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法將HAL1基因轉(zhuǎn)入模式植物煙草,對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的耐鹽性進(jìn)行評(píng)價(jià);并進(jìn)一步轉(zhuǎn)化木本植物小黑楊(Populus simonii×P.nigra)花粉植株以期獲得耐鹽楊樹(shù)新品種

2、.主要研究結(jié)果如下:1.以煙草為實(shí)驗(yàn)材料,建立了較為理想的植株組培再生體系.煙草葉片誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5 mg/L NAA,卡那霉素的選擇壓為50 mg/L,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化.2.獲得了煙草轉(zhuǎn)化再生植株.經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)8個(gè)煙草轉(zhuǎn)化子的再生苗,有6個(gè)獲得約900 bp的特異性擴(kuò)增譜帶,初步證明HAL1基因已整合到煙草基因組中.3.耐鹽試驗(yàn)

3、表明,在被檢測(cè)的900株煙草轉(zhuǎn)化再生植株中有481株可在含NaCl0.80﹪~1.50﹪的生根培養(yǎng)基中生根,生根率為53.45﹪;而對(duì)照煙草植株在含NaCl0.80﹪的生根培養(yǎng)基中生根率為0,僅在低于0.80﹪NaCl的生根培養(yǎng)基中生根.4.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的自由授粉子代進(jìn)行了子代測(cè)定.在含NaCl培養(yǎng)基中進(jìn)行的種子萌發(fā)試驗(yàn)顯示,轉(zhuǎn)基因煙草子代種子幼苗的耐鹽能力明顯優(yōu)于對(duì)照;PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,外源基因仍存在于煙草子代的基因組中.5.通過(guò)卡