釀酒酵母三個(gè)耐鹽相關(guān)基因克隆及其在棉花中轉(zhuǎn)化.pdf

1、鹽漬化是限制植物生長(zhǎng)和農(nóng)作物產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。棉花是鹽堿地的先鋒作物，是開(kāi)發(fā)利用鹽漬化土地的理想作物之一。通過(guò)基因工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高棉花耐鹽性已經(jīng)成為當(dāng)前棉花育種的一個(gè)迫切需求和重要方向。
　　相關(guān)研究表明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組中與耐鹽相關(guān)的基因有200多個(gè)。其中，ENA1(exitu natru1)基因編碼一種P型鹽誘導(dǎo)的ATPase，具有外排Na+、Li+的功能；轉(zhuǎn)化擬南芥后，

2、轉(zhuǎn)基因擬南芥在酸堿條件下的耐鹽性均有所提高。HAL1(halotolerance1)基因是ENA1基因的效應(yīng)子，通過(guò)提高反饋調(diào)節(jié)中K+吸收的量來(lái)促進(jìn)K+的吸收；ScHAL1基因轉(zhuǎn)化植物后不僅可以提高轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，而且提高其耐堿性和作物產(chǎn)量。釀酒酵母YCF1(yeast cadmium factor1)蛋白是液泡膜上S-谷胱甘肽結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，依賴于Mg-ATP，在重金屬Cd+、Hg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)解毒中起作用；轉(zhuǎn)ScYCF1基因擬南芥在較

3、高鹽脅迫下比野生型對(duì)NaCl的耐受性強(qiáng)。
　　本研究以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)As2.375為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)得到釀酒酵母耐鹽相關(guān)基因ENA1、HAL1和YCF1的mRNA序列，利用RT-PCR技術(shù)克隆了三個(gè)基因。其中ENA1(GenBank: NM_001180348.1)基因全長(zhǎng)3276bp，編碼1091個(gè)氨基酸；HAL1(GenBank: EF015596.1)基因全長(zhǎng)885b

4、p，編碼294個(gè)氨基酸；YCF1(GenBank: NM_001180442.3)基因全長(zhǎng)4548bp，編碼1515個(gè)氨基酸。對(duì)三個(gè)基因編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，三個(gè)蛋白的等電點(diǎn)分別為5.53、9.01和8.64， ENA1蛋白呈酸性且?guī)ж?fù)電，HAL1和YCF1蛋白帶正電荷呈堿性；親疏水性分析結(jié)果表明，ENA1和HAL1蛋白表現(xiàn)為親水性，而YCF1蛋白則是疏水性蛋白。同時(shí)，三個(gè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中都含有α螺旋、β-折疊片、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)

5、規(guī)則卷曲。
　　構(gòu)建綠色熒光融合表達(dá)載體 pBI121-ENA1::GFP、pBI121-HAL1::GFP和pBI121-YCF1::GFP，對(duì)三個(gè)基因進(jìn)行洋蔥內(nèi)表皮亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)ENA1蛋白和YCF1蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)，而HAL1基因編碼的蛋白則定位于表皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。棉花花粉的瞬時(shí)表達(dá)分析中，基因槍轟擊后花粉的綠色熒光都明顯增強(qiáng)，證明三個(gè)基因在棉花花粉中表達(dá)，為下一步使用基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因耐鹽材料奠定基礎(chǔ)。

6、>　　利用基因槍技術(shù)將三個(gè)基因分別活體轉(zhuǎn)化陸地棉(Gossypium hirsutumL.)材料中棉所12，并對(duì)收獲的T1代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行耐鹽性篩選和分子檢測(cè)。0.6％ NaCl鹽溶液脅迫下，轉(zhuǎn)釀酒酵母ENA1、HAL1和YCF1基因的轉(zhuǎn)基因種子的發(fā)芽率和根生長(zhǎng)情況均優(yōu)于對(duì)照中棉所12自交種，證明三個(gè)基因轉(zhuǎn)化棉花后均可以明顯提高種子耐鹽性。對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因種子進(jìn)行分子檢測(cè)，以載體質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，中棉所12自交種DNA為陰性對(duì)照，用所設(shè)計(jì)的