羅倫隱球酵母rho1基因的克隆及其在釀酒酵母中的轉(zhuǎn)化和表達(dá).pdf

1、細(xì)胞壁完整性(Cell wall integrity，CWI)信號通路是真菌中普遍存在一條保守通路，在生長、繁殖、對逆境脅迫的感受和調(diào)節(jié)中均具有重要作用。Rho1蛋白作為CWI通路的主要調(diào)節(jié)因子能夠與膜傳感器信號整合后激活下游MAPK信號通路，參與細(xì)胞壁合成等多種生理調(diào)控。羅倫隱球酵母是目前廣泛報道的一種用于果實(shí)采后病害的生防酵母，但因其遺傳背景尚不明確，導(dǎo)致其在基因水平上研究進(jìn)展緩慢。本課題通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)獲得羅倫隱球酵母的rho1基因

2、序列，在序列分析的基礎(chǔ)上通過釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)羅倫隱球酵母rho1基因，探究rho1基因轉(zhuǎn)化在提高重組酵母抗逆性和生防效力方面的可行性，研究結(jié)果對于明確rho1在生防酵母逆境適應(yīng)和抑制果實(shí)病害中的作用等具有重要意義。主要研究結(jié)果如下：
　　羅倫隱球酵母rho1基因序列和所編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析。通過對羅倫隱球酵母轉(zhuǎn)錄組高通量測序分析獲得rho1基因的cDNA序列為597 bp，運(yùn)用PCR擴(kuò)增得到rho1基因全長966 bp，包含

3、7個外顯子和6個內(nèi)含子，在基因結(jié)構(gòu)上與新型隱球酵母及其相似;對羅倫隱球酵母Rho1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示:Rho1蛋白由199個氨基酸組成，存在典型小GTP結(jié)合蛋白保守結(jié)構(gòu)域，并有6個α-螺旋結(jié)構(gòu)、6個β-折疊和5個Loop結(jié)構(gòu)，與已知的Rho家族蛋白空間結(jié)構(gòu)相似，因此推斷羅倫隱球酵母Rho1蛋白與已知Rho家族蛋白可能具有相似的生物學(xué)功能。
　　羅倫隱球酵母rho1基因克隆及在釀酒酵母中表達(dá)。用特異性引物擴(kuò)增得到rho1基因cDN

4、A全長序列，利用Clonexpress高效的DNA定向克隆技術(shù)將rho1基因連接到載體上，并將重組載體通過電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞，在含有150μg/ml的殺稻瘟菌素的培養(yǎng)基篩選得到轉(zhuǎn)化子，測序鑒定后構(gòu)建重組釀酒酵母SC-rho1。
　　重組釀酒酵母SC-rho1抗逆性和生防效力評價。重組釀酒酵母對溫度和滲透壓的耐受性明顯高于野生型釀酒酵母，同時在37℃和滲透壓脅迫下重組釀酒酵母能更加有效抑制梨果實(shí)病害，與野生型釀酒酵母相比分