釀酒酵母hGH克隆和消化道轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文釀酒酵母hGH克隆和消化道轉(zhuǎn)基因研究姓名：汪宗桂申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：發(fā)酵工程指導(dǎo)教師：鄭文嶺20040501A b s t r a c tH u m a n g r o w t hh o r m o n e ( h G H ) i sap o l y p e p t i d eo f1 9 1a m i n oa c i d ss e c r e t e db ye o s i n o p h i lc e

2、l l so f t h ea n t e r i o rp i t u i t a r yg l a n d ．T h ei m p o r t a n tp h y s i o l o g i c a lf u n c t i o nh a s p l a c e d t h e h G Hi n a d i s t i n c t i v e p o s i t i o n i n b i o t e c hp h a r m a

3、 c e u t i c a l i n d u s t r y ．C u r r e n t l y ，h G Hp r o d u c t sm a n u f a c t u r e db yr e c o m b i n a n tc l o n i n gh a sb e e nu s e di nt h em a r k e t ，h o w e v e r ，n og e n et h e r a p ya p p l i

4、 c a t i o n s f o u n di n c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s ．T h i ss t u d yd e s c r i b e da p r o c e s st h a tu s i n gr e c o m b i n a n th G H D N A ，a n d u s i n gS ．c e r e v i s i a ea sh o s t i n g

5、v e h i c l e s ，c o n d u c t i n gg e n et h e r a p yt h r o u g hm i c e d i g e s t i v et r a c t s ．C o m p a r e dw i t hc o n v e n t i o n a lg e n et h e r a p ya p p r o a c h e s ，t h ed e s c r i b e dp r o

6、 c e s si s n o to n l ym o r ee x p e d i e n t b u ta l s om u c h s a f e r ，e x h i b i t i n gg r e a t p o t e n t i a lb o t h i nc l i n i c a lp r o s p e c t sa n di nt h e o r e t i c a le x p l o r a t i o n

7、s ．T h er a t i o n a l ei s t h a tf o r e i g ng e n eo fi n t e r e s t ( G O D ，s u c ha s h G Hh a s b e e nc l o n e d i n t o a y e a s te x p r e s s i o n v e c t o r ，a n d t r a n s f e c t e d i n t o t h eh

8、o s t i n gS ．c e r e v i s i a e ，t h eh o s t i n gy e a s tw e r e t h e nf e dt ot h ea n i m a l s ．W i t hd u e p r o c e s s ，t h eG O I c o u l d b et r a n s f e r r e di n t ot h ea n i m a lt h r o u g h d i g

9、 e s t i v et r a c t ．E C H O c l o n i n gs y s t e mh a sb e e na p p l i e d ，b yw h i c ht W O S ．c e r e v i s i a ee x p r e s s i o np l a s m i d s o f h G Hw e r e c o n s t r u c t e d ，w i t h o n e a s t h e

10、 y e a s t e x p r e s s i o n p l a s m i dp Y E S ·h G Ha n dt h eo t h e ra s t h ey e a s t —m a m m a l i a ns h u t t l ev e c t o rp E S C —C M V - h G H ．A f t e rv e r i f i e du s i n gr e s t r i c t i o

11、ne n d o n u c l e a s e ，P e Ra n ds e q u e n c i n ga n a l y s i s ，C l o n i n go f t h eh G H g e n e i n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rh a v e b e e n c o n f i r m e d ，R e c o m b i n a n tp l a s m i d

12、w a st r a n s f e r r e d i n t o y e a s t h o s t c e l l s b y c o n v e n t i o n a ll i t h i u ma c e t a t ep r o t o c o l s ，t h e n ，t h ep o s i t i v ec l o n e sw e r ei d e n t i f i e da n ds c r e e n e

13、do nU r a c i la t r o p h i cs e l e c t i o nm e d i aa n db yc o l o n yP C R t e c h n i q u e s ．M o r ed e t a i l e ds t u d yo ft h er e c o m b i n a n ty e a s t sd e m o n s t r a t e ds t a b l ep l a s m i d

14、i n h e r i t a n c eo ft h et r a n s f e c t e dv e c t o r s ，a n db o t hy e a s ts t r a i n s s h o w e ds i m i l a r g r o w t hc u r v e s a n do t h e rb i o l o g i c a lf e a t u r e s ．T h e r e c o m b i n

15、a n t y e a s t h o s t i n gt h ep Y E S —h G H p l a s m i dw a si n d u c e d b yg a l a c t o s ei n d i f f e r e n t t i m e ，b e f o r e b r e a k i n g t h e c e l l w a l l s m e c h a n i c a l l y ．S D S —P A

16、G Ee l e c t r o p h o r e t i ca n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h em a x i m a le x p r e s s i o n o f h G H c a n b eo b t a i n e da f t e r16h o u r si n d u c t i o n ．M e a n w h i l e ，W e s t e r n b l o t

17、 t i n gr e s u l to ft h es a m p l e si n d i c a t e dr e c o m b i n a n ts t r a i nc o u l d e x p r e s s h G H ．A n i m a ls t u d i e so ft w or e c o m b i n a n ty e a s tc e l l sw e r ec o n d u c t e db yu

18、s i n gB a l b ／cm i c e ．E x p e r i m e n t a la n i m a l sw e r ef e dw i t hy e a s t sb e a r i n gd i f f e r e n tp l a s m i d s ．B l o o ds e r u mw a gc o l l e c t e da f t e rc e r t a i nw e e ki n t e r v