糖化酵母葡萄糖淀粉酶基因在釀酒酵母中克隆與表達.pdf

1、當前環(huán)境惡化、資源匱乏已經成為全球性問題，所以用乙醇作為一種新型燃料正更多的為人們所研究，開發(fā)新型的清潔能源是解決環(huán)境與資源等問題最直接有效的方式。在眾多的化石燃料中，酒精燃燒不僅清潔、可再生而且不產生有毒和溫室氣體。目前采用遺傳工程來構造出能夠直接水解淀粉生成酒精的工程菌株，新型菌株可以以淀粉為原料高效生產酒精，并且使酒精產量大大提升。
　　在工業(yè)生產上，在以淀粉為原料生產葡萄糖果糖糖漿工藝中，葡萄糖淀粉酶被廣泛利用。但現(xiàn)有葡萄

2、糖淀粉酶菌株分泌表達量較低，本實驗目的是將葡萄糖淀粉酶基因導入到釀酒酵母中以構建一株重組的釀酒酵母菌株，重組菌株能高效表達并分泌葡萄糖淀粉酶水解淀粉。
　　實驗根據NCBI中Genebank數據庫中的序列信息，采用PCR方法從糖化酵母中提取總DNA，并擴增出葡萄糖淀粉酶基因STA1，然后將PCR產物連入pUM-T載體構建成為重組質粒pUM-T-stal，將重組質粒轉入大腸桿菌，并進行測序，成功克隆得到STA1重組質粒。將提取的重組

3、質粒pUM-T-stal用BspDI和Acc65I酶切得到STA1并且轉入到釀酒酵母表達質粒pRS416中，取名為pRS416-stal。重組質粒pRS416-stal轉化入釀酒酵母感受態(tài)菌種中，獲得高效表達STA1工程菌。
　　通過誘導表達，重組的釀酒酵母葡萄糖淀粉酶酶活最高為120U/mL。測定葡萄糖淀粉酶酶學性質，結果為其最適溫度為60℃，40℃～70℃下穩(wěn)定性良好;其最適pH為5，在pH為4～6之間穩(wěn)定性良好。反應2h后酶