新型隱球酵母漆酶葡萄糖阻遏分子機(jī)制研究.pdf

1、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)是一種帶有莢膜的擔(dān)子菌。它作為一種條件致病真菌,可以感染免疫缺陷的個(gè)體引發(fā)致命腦膜炎。針對(duì)Cneofprmans如何致病的分子機(jī)制已經(jīng)做了大量的研究工作。C.neoformans中已發(fā)現(xiàn)的毒力相關(guān)特性主要包括:高溫(37℃)條件下的生長(zhǎng)能力,含銅漆酶(laccase)的產(chǎn)生和莢膜多糖(capsule)的合成等。
　　 本論文中,以C,neoformans菌株JEC21

2、(血清型D)作為模式來研究漆酶的葡萄糖阻遏抑制(repression)的分子機(jī)制。C.neoformans中漆酶的表達(dá)受到葡萄糖的抑制,潛在的分子基礎(chǔ)還不清楚。我們利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法(ATMT)構(gòu)建了一個(gè)T-DNA隨機(jī)插入突變文庫(kù),文庫(kù)容量大小約為200,000個(gè)轉(zhuǎn)化子。葡萄糖去抑制突變株在2％葡萄糖條件下可以合成黑色素,菌落顏色呈黑色或棕色,而野生型菌株JEC21黑色素的合成受到了抑制,菌落顏色呈白色。根據(jù)菌落顏色的變化,我

3、們篩選到了30株葡萄糖去抑制突變株,通過Southemblot發(fā)現(xiàn)83%的葡萄糖去抑制突變株含有單個(gè)T-DNA拷貝,通過反向PCR我們初步鑒定了10個(gè)葡萄糖抑制相關(guān)基因,還發(fā)現(xiàn)3株葡萄糖去抑制突變株中T-DNA破壞了LAC1(編碼漆酶)的啟動(dòng)子區(qū)。
　　 突變株LZM36中突變基因編碼一種tetraspaain蛋白,并且該蛋白屬于真菌Tsp2 tetraspanin家族,因此我們把該突變基因命名為TSP2-1(GenBank N

4、o.CNJ00820)。C.neoformans中,TSP2-1的缺失會(huì)導(dǎo)致黑色素的持續(xù)合成和LAC1的持續(xù)表達(dá),外源的cAMP(10 mM)不但可以恢復(fù)突變株tsp2-1△的去抑制表型,而且還可以恢復(fù)其莢膜缺陷。以上這些結(jié)果表明,在C.neoformans中,Tsp2-1可能通過依賴cAMP的蛋白激酶A(PKA)信號(hào)通路調(diào)節(jié)漆酶的表達(dá)抑制和莢膜的合成。TSP2-1還具有其他功能,例如,維持細(xì)胞膜的完整性、壓力抗性和致病性減弱等。這是首

5、次對(duì)真菌的Tsp2 tetraspanin家族成員Tsp2-1的功能描述。
　　 在本論文中,我們還從突變庫(kù)中分離到了另一株突變株LZM32。該突變株的菌落形態(tài)具有光澤呈流淌的粘液狀,疑似產(chǎn)生了過多的莢膜,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突變株LZM32中,T-DNA破壞了一個(gè)未知功能的新基因(GenBank No.CNF01870)。該基因編碼的蛋白含有一個(gè)保守的Zds C結(jié)構(gòu)域(pfam08632,殘基594-632),S.cerevisia

6、e和S.pombe中的Zds蛋白也含有保守的Zds C結(jié)構(gòu)域。因此,我們把這個(gè)基因命名為ZDS3。通過定向敲除得到了突變株zds3△,突變株zds3△具有和LZM32一樣的表型,ZDS3參與維持細(xì)胞正常形態(tài),細(xì)胞壁的完整性和鈣離子耐受力。ZDS3的其他功能包括:侵入性生長(zhǎng),高溫的耐受力和抗氧化。ZDS3是C.neoformans莢膜合成所必需的,ZDS3缺失導(dǎo)致zds3△菌株失去了致病性。Zds3的同源蛋白只存在于擔(dān)子菌和子囊菌中,因此