氧化葡萄糖桿菌(Gluconobacter oxydans)DHA3-9菌株葡萄糖酸轉(zhuǎn)化及葡萄糖代謝酶系的研究.pdf

1、氧化葡萄糖桿菌Gluconobacteroxydans的細(xì)胞膜上存在眾多脫氫酶，可將多羥基底物氧化成對(duì)應(yīng)的醛、酮、酸，并直接分泌到培養(yǎng)基中。細(xì)胞膜結(jié)合的葡萄糖代謝酶系具有底物特異性和不完全氧化性，這種獨(dú)特的不完全氧化性質(zhì)可將葡萄糖轉(zhuǎn)化成D-葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、5-酮基-D-葡萄糖酸等化合物。D-葡萄糖酸是化學(xué)、醫(yī)學(xué)及食品等產(chǎn)品的重要中間體，市場(chǎng)需求量較大，促使人們不斷研究和改進(jìn)D-葡萄糖酸的生產(chǎn)工藝。由于氧化葡萄糖桿菌具有

2、耐酸、耐高濃度葡萄糖的特點(diǎn)，與工業(yè)上廣泛采用的黑曲霉發(fā)酵法相比，利用氧化葡萄糖桿菌進(jìn)行D-葡萄糖酸制備，具有環(huán)境污染小和生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)。
　　 本研究對(duì)從花朵中分離到的一株G.oxydansDHA3-9進(jìn)行了葡萄糖氧化桿菌的D-葡萄糖酸轉(zhuǎn)化工藝的可行性探索及D-葡萄糖代謝酶系研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.菌株DHA3-9的D-葡萄糖酸脫氫酶基因（gadH）的克隆與敲除:通過(guò)PCR得到D-葡萄糖酸脫氫酶基因gadH的

3、部分序列，通過(guò)DNA序列比對(duì)顯示該酶與G.oxydans621H的D-葡萄糖酸脫氫酶相似度為85％。采用同源重組的方法將DHA3-9的gadH成功敲除，使菌株不再積累2-酮基-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconate，2KGA)。
　　 2.菌株DHA-ΔgadH的高濃度D-葡萄糖酸轉(zhuǎn)化:用無(wú)CaCO3的葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)DHA3-9能夠顯著降低副產(chǎn)物5-酮基-D-葡萄糖酸(5-keto-D-gluconate，5KGA)的

4、積累量，并利用該培養(yǎng)基在高濃度初始葡萄糖下培養(yǎng)DHA-ΔgadH，于30℃連續(xù)培養(yǎng)72h，最終D-葡萄糖酸產(chǎn)量達(dá)142.25g/L，但仍有50％葡萄糖未被轉(zhuǎn)化，未來(lái)可通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件獲得更高的葡萄糖酸產(chǎn)率和葡萄糖利用率。
　　 3.菌株DHA3-9的膜結(jié)合D-葡萄糖脫氫酶基因(mgdH)的克隆與敲除:通過(guò)PCR得到D-葡萄糖脫氫酶基因mgdH的部分序列，通過(guò)DNA序列比對(duì)顯示該酶與G.oxydans621H的D-葡萄糖脫氫酶相似

5、度為97％。采用同源重組的方法將DHA3-9的mgdH成功敲除，使菌株轉(zhuǎn)化D-葡萄糖酸的能力降低98％。
　　 4.菌株DHA-ΔmgdH的葡萄糖代謝酶系研究:野生菌DHA3-9與突變菌ΔmgdH的葡萄糖代謝產(chǎn)物經(jīng)離子色譜分析表明，ΔmgdH代謝產(chǎn)物中丙酮酸和二羥基丙酮濃度增加且檢測(cè)到野生菌代謝產(chǎn)物中沒(méi)有的乙酸。高濃度乙酸可顯著抑制突變菌ΔmgdH的葡萄糖代謝。結(jié)果表明，突變菌ΔmgdH主要通過(guò)另一條途徑進(jìn)行葡萄糖代謝，即糖酵解