棉花中三個(gè)激素相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、棉花是世界上最重要的纖維作物和重要的油料作物之一。棉纖維是己知纖維素純度最高的天然資源之一，在世界紡織工業(yè)中具有重要的經(jīng)濟(jì)地位。棉花的生長(zhǎng)和棉纖維的發(fā)育都離不開(kāi)植物激素的調(diào)節(jié)，激素在棉花的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著非常重要的作用。因此棉花中激素酶類基因的克隆既有助于植物細(xì)胞發(fā)育分子機(jī)理的闡明，也為棉纖維發(fā)育的生物學(xué)研究打下基礎(chǔ)。 本研究從優(yōu)質(zhì)材料7235不同棉纖維發(fā)育混合cDNA文庫(kù)中分離出三個(gè)cDNA克隆。其中一個(gè)克隆編碼腺苷高半

2、胱氨酸水解酶(命名為GhSAHH)。反義表達(dá)該基因可以增加細(xì)胞中游離的細(xì)胞分裂素的含量，誘導(dǎo)植物抗逆性防御。該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度為1598bp，利用5’RACE技術(shù)得到上游318bp的片段，與原序列拼接后，得到一1916bp的cDNA序列。其開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為1458bp，編碼485個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物理論分子量約為53.2kDa，理論等電點(diǎn)為5.69，ORF上游具同框終止子。該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽序列，故可能是胞內(nèi)酶。BLAST‘結(jié)果

3、表明，與來(lái)源于其他植物的這類腺苷高半胱氨酸水解酶基因有較高的同源性，GhSAHH與紫花苜蓿(Medicago sativa)腺苷高半胱氨酸水解酶(GenBank登錄號(hào)：ALFMSA2S)之間一致性為83％。從表達(dá)特征上來(lái)看GhSAHH呈組成性表達(dá)，其在根、莖、葉中均有表達(dá)，而在纖維發(fā)育早期表達(dá)量較高，后期表達(dá)量逐漸降低。Southem雜交結(jié)果表明GhSAHH基因在陸地棉基因組中可能為單拷貝。利用本實(shí)驗(yàn)室陸地棉遺傳標(biāo)準(zhǔn)系TM-1和海島棉海

4、7124培育的140個(gè)BC<,1>作圖群體，將GhSAHH定位在染色體20上。淹水脅迫下，GhSAHH在棉花葉片中下調(diào)表達(dá)，誘導(dǎo)植物抗逆性防御。 第二個(gè)克隆編碼生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白(命名為GhARP)。該基因編碼產(chǎn)物是生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的早期響應(yīng)蛋白。該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度1696bp，其開(kāi)放讀碼框編碼長(zhǎng)度為1074bp，編碼357個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物理論分子量約為38.9kDa．，理論等電點(diǎn)為6.62。該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽序列，故可能

5、是胞內(nèi)酶。BIAsT結(jié)果表明，與來(lái)源于其他植物的這類生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白基因有較高的同源性，GhARP與葡萄(Vitis vinifera)生長(zhǎng)素應(yīng)答蛋白(GenBank登錄號(hào)：．AY082522)之間一致性為85％。從表達(dá)特征上來(lái)看GhARP屬棉花細(xì)胞組成性表達(dá)，其在根、莖、葉及棉纖維各時(shí)期都表達(dá)量較高，看不出明顯差異。Southem．雜交結(jié)果表明GhARP基因在陸地棉基因組中可能存在多個(gè)拷貝。已將GhARP正反義片段構(gòu)建入CaMV35S的

6、植物表達(dá)載體pBIl21，正進(jìn)行棉花的轉(zhuǎn)基因研究。淹水脅迫下，GhARP在棉花葉片中表達(dá)量在脅迫后六天達(dá)最大值，隨后逐漸降低。第三個(gè)克隆編碼乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(命名為GlaEREBP)。該基因編碼產(chǎn)物是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的一個(gè)重要調(diào)控蛋白。該cDNA克隆插入片段長(zhǎng)度1563bp，其開(kāi)放讀碼框編碼長(zhǎng)度為1191bp，編碼396個(gè)氨基酸，編碼產(chǎn)物理論分子量約為38．9kDa，理論等電點(diǎn)為6.62。該氨基酸序列無(wú)信號(hào)肽序列，故可能是胞內(nèi)酶。

7、BLAST結(jié)果表明，與來(lái)源于其他植物的這類乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白基因有較高的同源性，GhEREBP與陸地棉(Gossypium hirsutum)的乙烯應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(GenBank登錄號(hào)：AY817134)之間一致性為96％。從表達(dá)特征上來(lái)看GhEREBP屬纖維細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表達(dá)，其在根、莖、葉中均有表達(dá)，而在纖維發(fā)育早期表達(dá)量較低，纖維伸長(zhǎng)發(fā)育期表達(dá)量較高。Southem雜交結(jié)果表明GhEREBP基因在陸地棉基因組中可能存在多個(gè)拷貝。將G